Laboratorijske opreme - rdečkam

Video: laboratorijska steklovina

Pridobitev antiserumov. Tehnika pridobitev antiserume za virusne antigene, opisane v podrobnem HABEL in Salzman (1972). Najbolj priročno živali za antiseruma proti virusu rdečk, kot tudi proti večini virusov, je zajec. Najpogostejša sheme immunizatsii- trojna vnos v vene ušesa s 5 ml tekočine, ki vsebuje virus z intervalih 2-3 tednov. Zajci so bled en teden po zadnji injekciji. Tekočina kultura uporablja za cepljenje ne sme vsebovati velike količine beljakovin. Za pripravo takšnega tekočo monoplast okuženih celic skrbno sprati iz prejšnjega mediju in nato uvedemo vzdrževalno medij, ki vsebuje nobene serum, ki se uporablja za imunizacijo.
V našem laboratoriju za proizvodnjo velike količine sirotke uspešno uporablja ovce (RG Desyatskova, EF Opochinsky, 1973). Cepljenja so bile izvedene v treh izvodih s sevom rdečk virus-2 Sp. Kadar sta prvi in ​​drugi imunizaciji smo virus injiciramo v veno istočasno, in intramuskularno v odmerku 3,3 8,1H108 pfu, tretji - samo intravensko v odmerku 4,2H108 pfu. Intervali med prvim in drugim dajanjem virusa so bili 3 tedne, in med drugo in tretjo - 1 teden. Žival bled 7 dni po zadnji injekciji. Antigenagglyutininov titri v serumu je 512-1024.
Izolacija in identifikacija virusa rdečk. V praksi lahko virolog morali izolirati virus iz nosu ali kri rdečk bolnika. V našem laboratoriju, uporaba namenske opreme in posledično identifikacija virusa rdečk, zapravljajo RG Desyatskovoy.
Tamponi z nazofaringealnega zaključka objavljen v sterilne epruvete, ki vsebujejo 3 ml Hanksovimi raztopine, ki vsebuje 0,5% želatine, 1000 U / ml penicilina, 500 U / ml streptomicina in 20 U / ml nistatin. Manipulacija ob sluz iz nosu mora biti energichno- tudi zaželene ob sluzi iz nosu, ki je v vsako nosnico vstavi za nekaj minut vatirano palčko. Kri je bila vzeta iz prsta ali veno v ceveh z suho heparinom. Vzorce smo transportiramo v laboratorij v ledu in v primeru potrebe Pred študijo smo hranili pri -40 °.
Setev izvedemo na vzorcih epruvete kulture za RK13 celic. Sejanje celice v vsakem odmerku epruvete bilo 120 000-150 000 celic v 1 ml medija 199, ki vsebuje 10% govejega seruma. Pred nacepitvijo je bila izvedena po tvorbi monosloja, običajno v 3-4 dneh. V vsako epruveto dodamo 0,5 ml materiala iz nazofarinksa in kri 0,1 ml. Na vsakem vzorcu, odvzetem 3-4 cevi. Po eni uri stika na sobni temperaturi v epruveti dodamo 1 ml medija 199 s 6% ogrevanim obdelan kaolin govejega seruma in inkubirali pri 35 °. Prilagoditi in kopičenje virusnih vcepimo kultur so bili slepi prehod 3-4 vsakih 8 do 10 dni.
Navedba in identifikacija virusa rdečk je bila izvedena s pomočjo interference z virusom vezikularnega stomatitisa (VSV) v isti celični kulturi. Omogočanjem BBC virus v dozi 100-320 TCD 50 so se 7-9 dni po okužbi s preskusnim sredstvom. Reakcijsko Rezultati po 48-96 urah upošteva pri kontrolni cevi omogočajo povzroča virus jasno degeneracije. V kulturah, ki kažejo odpornost ukrepom zračnega sile lahko kažejo na prisotnost motečih virusno sredstvo. .
Za identifikacijo izoliranih virusnih sevov uporabljenih hiperimunih serumu ovce imunizirali z virusom rdečk (cm. Zgoraj). Lahko uporabite tudi protiserum katerega koli izvora. Serum smo razredčili 1: 8 zmešamo z enakim volumnom testnega virusa v titru 1: 10 in inkubirali 2 uri pri sobni temperaturi. Srednje vroči razredčino 0,5% laktalbumin v raztopini raztopini Earle. V vsako epruveto kulture smo RK13 celice dodamo 0,2 ml seruma in virusa ter inkubirali eno uro pri sobni temperaturi (kulturna tekočina preden se odstranjeni). Cevi nato dodamo 199 mediju, ki vsebuje 2% kaolin obdelamo govejega seruma in kulturo smo inkubirali na 35 °. Po 7 dneh inkubacije, odstranimo kulturna tekočina in cevi dodamo ml virusa v dozi, ki dovoljuje 100-320 TCD50 razredčimo z istem mediju. Reakcijsko zmes šteje po pojavu degeneracije kontrolo celične kulture. Prisotnost citopatskega učinka v eksperimentalnem kulturi dokaz virusa posebnega nevtralizacijsko seruma. Hkrati je bil serum testirali smo spremljali toksičnost in odmerek deluje popustljiv virus.

Naš laboratorij je uspešno uporablja za "klasičen" način označbo in identifikacijo virusa rdečk uporabo primarnih kultur zelene opice ledvic in tako, da se virus ECHO in (Parkman e. A., 1964b), pa je po našem mnenju ta tehnika ni primerna za običajna praksa virologije.
identifikacijske metode, ki temeljijo na neposrednem opazovanju citopatskega učinka virusa rdečk, se le redko uporabljajo za odkrivanje obtoku sevov virusa, kot "divje" sevi običajno ne citopatski učinek v kulturi brez predhodnega prilagajanja. Manifestacije virus CPP rdečk na splošno zelo izbirčen in pogosto odvisni od celičnih sevov, vrsto medija, serumi, itd E., ki nam je dal razlog, da se priporoči za izolacijo virusa posredni metodi.
Titracija virusa. virus rdečk titri tako posredni metodi na podlagi motenj in neposredno, na podlagi citopatskega učinka neposredno spremljati. Indirektna metoda titracije lahko uporabimo postopek opisan zgoraj v opisu virusne označbe. To je potrebno le, da vključuje korak priprave desetkratne razredčine virusa. Kot nosilni medij po inokulaciji celičnih kultur v različnih razredčitve virusa, uporabljenega medij 199, ki vsebuje 2% kaolina obdelanega govejega seruma. Za titra pri čemer največjo razredčitev, ki ščiti 50% okuženih kultur iz degeneracije povzroča popustljiv virus. Virusne titre so izraženi InDso / ml (motečih odmerek).
Za titracijo virusa, ki ga neposredni metodi s pomočjo celične kulture izpostavljeni virusu rdečk CPE. Najpogosteje je RK13 (Hopps e. A., 1969), manj Sirk in BHK21. Značilno je, da je cev vsebuje kultura Odpipetiramo 0.2 ml ustreznih desetkrat razredčitve virusa in po stiku za eno uro pri sobni dvigovanja temperature medija. Za pokazal najvišje titer redčenja virusa citopatskega učinka postane 50% inokuliranih kultur (TCD50).
V raziskovalnih laboratorijih za titracijo virusa rdečk je s plak testom pogosto uporabljajo. Najpogosteje se uporablja za te namene RK13 celic. Iz praktičnih laboratorijih, ta metoda je nekoliko zapletena, tako da ne bo dal podroben opis, in omejiti ustreznih povezav (RG Desyatskova, Uradni list Andzhaparidze, 1968- Hopps e. A., 1969).
Serološke študije. Osamitev virusa rdečk - zelo dolgotrajen postopek, in je verjetno, da bi se čim bolj razširjeni. Za praktične namene, veliko večja vrednost so serološki testi. Uporabite jih lahko za nekaj dni, da se potrdi diagnozo rdečke, raziskati imunski status določene skupine prebivalstva, za ugotavljanje učinkovitosti cepljenja in tako naprej. E. Protitelesa proti virusu rdečk se odkrijejo pri nevtralizaciji reakcije (pH), inhibicije hemaglutinacije (HI), vezanja komplementa ( RAC) in imunofluorescenčni (IFA). V praksi je najbolj razširjena HIT zaradi svoje preprostosti, specifičnosti in hitrostjo pridobitev rezultatov. Tukaj je podroben opis te reakcije.
Inhibicija hemaglutinacijo. HI virusa rdečk Stewart et al prvi opisal leta 1967. Ugotovili smo način za odstranitev virusa rdečk toplotno obstojnega serumu inhibitorji hemaglutinacije, ki sta. | 3-lipoproteinov. V ta namen v serumu uporabljena v reakciji, obdelamo z 25% suspenzije kaolina. V našem laboratoriju se v glavnem uporablja nekoliko spremenjeno metodo teh avtorjev. Proučevanje več kot 10.000 serumov, lahko priporočamo ta način kot povsem točne in najbolj dostopna za virologijo laboratorij naše države.
Kot dekstroza-želatina-veronalnem raztopine topila pufra (JW).
Kaolin. 25% suspenzija kaolina bila pripravljena po Clarke in Casalsa (1958) s postopkom po pranju štirikrat v fosfatnem pufru pH 7,2 rešitev. Del 250 g kaolina zmešamo s 750 ml puferske raztopine, temeljito stresamo in pustimo, da se usede. Po zamenjavi postopek Supernatant ponovi s svežo raztopino. Končno suspenzijo v avtoklavu 30 minut pri 115 atm. in nato shranjeni pri 4 °. Pred uporabo je fosfatni pufer raztopina zamenjan z enako količino DZHV.
Eritrocitov. Raje rdečih krvnih celic odraslih golobov, ampak tudi sprejeti enodnevne piščance eritrocitov. Pri piščancih so bled jih obglavili, in od golobov donatork - iz srca. V tem primeru golob istočasno sprejmejo na 5 ml krvi v brizgi s 5 ml Alsevera raztopine. Kri do uporabe (običajno v enem tednu), shranjenih v raztopini Alsever je v razmerju 1: 10, 1: 20. Pred uporabo eritrocite smo filtrirali in sprali trikrat desetkratno znesek DZHV z zaporednim centrifugiranjem 10 minut pri 1200 obr / min. Iz oborine pripravimo 0,25% eritrocitov suspenzija za reakcijo in suspenzijo 50% za zdravljenje serumov.
Obdelava sera. Test serume odstraniti nespecifičnih zaviralcev preprečiti spontano aglutinacijo in segrevamo pri 56 ° C za 30 minut in obdelamo s kaolinom in eritrocite. 0,1 ml segretega sirotke dodamo 0,3 ml 25% kaolina suspenzijo in inkubirali zmesi na sobni temperaturi 20 minut, nekajkrat močno tresenje. Nato smo zmes centrifugirali 15 min pri 2000 vrt / min in brez sesanju supernatant smo dodali 0,05 ml 50% eritrocitov suspenzije. Po eni uri stika na 4 °, v katerem mora Eritrocite 2-3 krat rahlo stresamo, zmes ponovno centrifugiramo pri 1500 vrt / min za 10 min. Postopek centrifugiranje se lahko nadomesti z inkubacijo pri 4 ° C preko noči. Serumski supernatant razredčimo v razmerju 1: 4.
Izjava o HAI. Reakcijo izvedemo v makro- in micromodifications. Pri oblikovanju so reakcijske makrometodom plošče plastični vrtine z zmogljivostjo 1,5 ml. Mikrometodiku izvede z uporabo mikrotitranje Takacs podjetje "Metrimpeks" (Madžarska). Pri titraciji pripravo antigen delovnega eritrocitov suspenzije in razredčitve testnih serumov znamke DZHV ki vsebuje 0,2% govejega albumina se doda stabilizira reakcijo. Ker lahko uporabimo humani plazemski albumin albumina govejega, globulin izveden iz količine odpadkov, plazmo ali albumin raztopine za intravensko uporabo (Desyatskova G. R. et al., 1971).
Ker makro in microreaction izvedemo identično opis makroreaktsii in obseg sestavin, uvedena v microreaction, čaka v oklepajih. Ko je antigen titriramo za ugotavljanje operacijskega odmerka dvakratne razredčitve so izdelane iz 0,4 (0,05) 0,25 ml-% eritrocitov suspenzijo uvedemo v volumnu 0,2 (0,025) ml. Vse sestavine so ohladili
Daj 0 g. v ledeni kopeli. Rezultati omogočajo 1,5-2 h inkubacije pri 4 °. Pri redčenju antigena v microreaction bolje uporabiti mikropipeto. Za antigenom titer vzeti največjo razredčitev, ki povzroči aglutinacijo razlikuje. Delovni dozo antigena v formulaciji HI vsebuje 4 enote.
Dvojen razredčitve testnega seruma izvedemo v volumnu 0,2 (0,025) ml. Za je vsako razredčitev seruma dodamo 0,2 (0,025) ml redčenje antigena, zmes pustimo stati eno uro pri sobni temperaturi in nato dodamo 0,2 (0,025) ml 0,25% eritrocitov suspenzijo ohladili v ledu. Reakcijo smo omogoči 2-3 h inkubacije pri 4 °.
Pri oblikovanju Reakcijsko micromethod serumu antigen boljši stik dalj časa na 4 ° C 2 uri, in rezultati reakcije s to metodo izvedemo v večji meri odvisne od upoštevanja hlajenju.
Serum titer velja najvišja hemaglutinacijo za redčenje popolnoma prepričljivo. Serum se šteje za negativno v primeru, ko je zatiranje aglutinacije niso opazili pri razredčitvi 1: 8.
Vsaka titracija serije spremljajo ustrezne kontrole: titracijo imunskega seruma z znano titer protiteles negativnem serumu, kontrolnega seruma in rdečih krvnih celic v prisotnosti spontanega aglutinacije. V zadnjih dveh nadzora, pomanjkanje ustreznih komponent nadomestilo ustrezni volumen JW. Zaželeno je, da uporabite bidestilirano vodo.
Trenutno ni standardni metodologiji za določitev virus rdečk HI, ki bi zravnal rezultatov, pridobljenih v različnih laboratorijih. Številne modifikacije te reakcije, katere bistvo je predvsem pri uporabi različnih metod zdravljenja serumov za odstranitev nespecifičnih inhibitorjev, kakor tudi uporaba različnih pufrov in eritrocitih.
Poleg odstranjevanje inhibitorjev z adsorpcijo na kaolin, se pogosto uporablja za obarjanje serume z zmesjo heparina in manganov klorid (Cooper npr. A., 1969a) in v zadnjem času ugotovi aplikacij obdelavo serumov z zmesjo sulfata dekstrana in kalcijevega klorida (DS-C) (Haukenes, Aasen, 1971).
Kot pufrske raztopine, razen DZHV uporabo boratnega pufra z 0,4% albumina (Babs) - Isto raztopino pomešamo s fosfatnim pufrom (Babs + PBS) (.. Halonen th, 1967) in nazadnje in HEPES pufer ali HEPES albumin in želatina (HSAG) (Schmidt npr. a., 1971).
Omembe vredne so nekateri na novo predlagana HAI sprememba. Tako Gupta in Peterson (1971) so razvili tehniko za uporabo formalinized eritrocitov z uporabo nove varovalni sistem-Schmidt Dennis (1972) uporablja človeške eritrocite filter 0 ima številne prednosti pri praktični primenenii- Quinn et al. (1972) z obdelavo tripsina človeških eritrocitov spremembe da poveča njihovo občutljivost in odpira nove možnosti za standardizacijo reakcije.
Naraščajoča uporaba dobi testira serumu makroglobulina (IgM protiteles 19S). Ta test lahko potrdi diagnozo rdečkam v enem dnevu, saj je prisotnost posebne IgM v serumu kaže na trenutno okužbo. Najenostavnejša metoda določanja IgM, čeprav je vsaj točni, namenjena zdravljenju serumov 2-merkaptoetanola (2-Me) (RG Desyatskova, E. F. Opochinsky, leta 1973 Banatvala npr. A., 1967).
Serum smo obdelali z 2-ME (končna koncentracija 2-Me - ODM) za eno uro pri 37 ° in nato testiramo v HAI izvedena na običajen način. Vzporedno se ista seruma titriramo, vendar ne obdelamo z 2-Me. 2-ME uničuje IgM in torej razlika v titrov protiteles, določenih v vzorcih seruma, odvzetih pred in po obdelavi z 2-ME lahko ocenjuje
prisotnost IgM. Šteje se, verodostojna vsaj štiri-kratno razliko v kredite.
Bolj zapletene metode identifikacije makroglobulina so centrifugiranjem v saharoze gradient (Field, Murphy, 1972), filtracija gel (Burgin-Wolff e. A., 1971) in posredni imunofluorescenco (Haire, Hadden, 1972), vendar te metode niso dovolj uporabna v širok praksa zaradi njihove tehnične zahtevnosti. Zaradi tega ne bomo podroben opis in navedbo, da omejijo odkrivanje protiteles proti s presnovo nevtralizacije (Parkman npr. A., 1964- Furesz npr. A., 1969- Kobayashi npr. A., 1973), reakcija vezanja komplementa ( sever e. 1965.,) in z imunofluorescenco (Brown e. a., 1964).
Trenutno obstaja jasna potreba po razvoju enotne metodologije za določanje seroloških testov (vsaj Hai) in v proizvodnji standardnih komponent za njihove produkcije, kar bi povečalo natančnost rezultatov in bi zelo poenostavili organizacijo množičnih seroloških raziskav.

Video: Nemiroff - steklovina, petrijevko in epruveta 2 v 1

Video: Laboratorijska oprema in stekleni izdelki 31