Immuno diagnostičnih tehnikah - sistemski eritematozni lupus, sistemska skleroderma, revmatoidni artritis

Video: Konferenca "Prilagojene tehnologije v revmatologijo"

POGLAVJE IV
ELISA za diagnosticiranje imunske motnje
Povezan imunski test je eno od področij najbolj hitro razvijajočih se kemijske encimologije. To je zato, ker v tej metodi edinstven imunokemijska preizkus specifičnost v kombinaciji z visoko detekcijo občutljivosti encimski markerji. Visoka stabilnost reaktantov, enostavnost postopkov za prijavo so nespornih prednosti metode, ki prispeva k njeni široko uporabo v medicini.
Metoda temelji na specifične vezave ustreznih protiteles definiranih spojin. Klasične metode za imunskim testom, ki temelji na tvorbi antigena s protitelesi v prisotnosti oborine (pelete). Navedba tvori kompleks antigen-antitelo v raztopini lahko izvedemo, če ste v enem izmed izhodnih komponent reakcijski sistem uvesti oznako, ki zlahka določimo z ustreznimi fizikalno zelo občutljivo metodo. V ta namen se uporabljajo izotopsko, encimske, fluorescentne, paramagnetne nalepke, je uporaba katere je bilo mogoče povečati občutljivost imunoloških metod v milijonih časih, in da se zmanjša čas analize do nekaj ur.
Za izvedbo takšne analize je treba izvesti učinkovito ločevanje kompleksov iz prostih komponent. Ta problem je enostavno rešiti, če je eden od sestavnih delov protiteles antigen par trdno imobiliziran na trdnem nosilcu. Imobilizacija se prepreči agregacijo v raztopini in izvesti fizično ločitev oblikovanih imunskih kompleksov s prostimi komponent.
Novi imunokemijska metode, ki temeljijo na uporabi označenih reagentov, so ugotovili širok sprejem za kvantitativno določitev biološko aktivnih spojin zelo različne strukture - od nizko molekulsko do visoko molekulsko hormoni virusi in cele celice.
Največji razvoj med njimi je bil radioimunski, kot je predlagano v poznih 50-ih. S sposobnostjo, da opredelijo z etiketo, ki je izotop 1-125, v zelo majhnih koncentracijah, je bilo mogoče doseči visoko analizo občutljivosti. Razvoj te tehnike je bilo prelomno za razvoj imunoloških metod analize, je postavil temelje za vrsto različnih metod, ki uporabljajo označene spojine. Za razvoj metode, so avtorji Yalou R. in S. Berson leta 1977 prejel Nobelovo nagrado.
Poleg prednosti metode radioimunskega ima svoje slabosti, ki vključuje visoke stroške opreme in okolja, negotovost v zvezi z možnostjo radioaktivne kontaminacije okolja z izvajanjem velikega števila testov in potrebo po posebnih varnostnih ukrepih in visoko usposobljeno osebje. To je te težave so bile izhodišče za iskanje alternative radioimuno, vendar ohranja svojo visoko občutljivost, specifičnost in izraznost.
V zadnjih desetletjih, metode imunsko analizne razvila intenzivno tako na teoretični in praktični pogoji, in do zdaj so bile oblikovane v samostojni znanstveni smeri, ki imajo pomembne vloge. Uporaba trdnih nosilcih za adsorpcijo ali kovalentno imobilizacijo protiteles, čemur sledi specifično vezavo testne spojine na imunski in odkrivanje imunskih kompleksov oblikovanih po encime označene komponente za zagon metode v trdni fazi (heterogena) encimskim imunotestom.
Te metode so najbolj pogosti in se uporabljajo za določanje širok spekter tako nizko molekulsko maso in visoko molekularne mase - protitelesa, peptidov, virusnih in bakterijskih antigenov, farmakoloških sredstev.
Posebnega pomena za širjenjem ELISA je razvoj v praksi kot nosilci adsorpcije imobilizacijo protiteles in antigenov posebno deske polistirena, ki vsebuje 96 vrtin. Dejstvo sorpcijo na površinska protitelesa polistirena bila določena v sredini 60-ih in na začetku uporabimo v metodah radioimunsko. Izvajanje v praksi polistirena plošč encima imunološki nam omogoča, da se poenostavi postopek, ki se za njeno izvajanje. posebnih naprav, ki avtomatizira korake dodajanjem reagentov za opravljanje pranje in hkratno zapisovanje katalitične aktivnosti oznaki encima v vsakem od luknje plošče so izdelane.
Najpogostejši sheme encimskim imunotestom so naslednji: konkurenčna, zaporedno nasičenost tehniko, "sendvič" -method in metodo za določanje antigenov z oznako antispecies protitelesa.
Načelo konkurenčnega imunotestom je določen z istočasnim dodajanjem antigenov in protiteles za encimsko označeno, tako da je sistem za ravnotežje in nato merjenje oznako encimske v kompleksu s protitelesom ali nevezanega oznako antigena.
Za razliko od konkurenčnega encimskim imunotestom je zaporedna nasičenost tehnike, ki temelji na zaporednem interakcije protiteles s prvim določimo in nato z antigenom encimsko označeno. Analiza je mogoče na dva načina. V prvem primeru je označeno antigena dodamo direktno k inkubaciji druga zmes, ki vsebuje protitelo in preskusnega vzorca. V drugem primeru je (mogoče le ob uporabi ELISA) so imunsko po prvi reakciji od nevezanih kompleksov izperemo in nato označeni antigen aplicira. Ta metoda se izognemo možni inhibitorni učinek preiskovanih komponent v biološkem fermentmarker tekočine. Koncentracija konjugata veže na protitelesa je sorazmerna z začetno koncentracijo in antigen je značilno vsebnosti v vzorcu.
"Sendvič" -method temelji na uporabi imobiliziranega in označenega specifično protitelo in je eden izmed najpogostejših pristopov k analizi večvalentne antigenov. Metoda obstaja v več različicah. Najširše sprejeta vključuje dva koraka. Prva določena antigen reagiramo z imobiliziranimi protitelesi, nato speremo in dodamo immunoabsorbent encimsko markirano protitelo, obseg vezave, ki z determinantami prosti antigen, sorazmerno z začetno koncentracijo. Sekundarni izperemo substrat in zabeleži število oznak, povezanih z immunoabsorbent.
Konkurenčni postopek z uporabo antispecies označenega protitelesa omogoča določanje različnih antigenov (tako mono- in polideterminantnye) z uporabo iste označenih protiteles. Test smo izvedli, kot sledi. je določena in specifična protitelesa na antigen dodamo K antigen imobiliziran na nosilcu. Med inkubacijo so imobilizirane antigene določiti in tekmujejo pri vezavi protitelesa mest. Posledično je nosilec tvorjen antigen-protitelo kompleksa, kjer je koncentracija protitelesa sorazmerna z začetno koncentracijo antigena. Ko se odstranjevanje odvečnih nevezanih komponent dodamo k podpori antispecies protitelesa-encima z oznako tvori kompleks s specifičnimi protitelesi. Po odstranitvi odvečnega označeni koncentracijo protiteles posnete sledi na nosilcu. Tako je metoda združuje načela konkurence in "sendvič" -Analiza.
Seveda, za vse te metode je treba povezati testom na protitelesa proti imenovanemu substrata. Tako pomembna točka je, da dobimo antiserume in poliklonska protitelesa. V ta namen trenutno uporabljena imunizirane živali Freudov adjuvans, čemur sledi izolacija in čiščenje protitelesa, tj odstranitev nespecifičnih protiteles. V nekaterih izvedbah je encim imunski test z uporabo encima konjugatov ne s celotnim imunoglobulinsko molekulo, in tako njegov fragment, ki se specifično veže na molekulo antigen, Fab fragmenta.
Poliklonska antiserumi imajo pogosto visoko navzkrižno reaktivnost, ki otežuje ali celo onemogoča njihovo uporabo v imuno. Glavna prednost monoklonskih protiteles je možnost pridobivanja neomejene količine identične med serijami fizikalno-kemijskih lastnosti. Glavna lastnost, ki temelji na uporabi monoklonskih protiteles je zelo specifično interakcijo. Uporaba monoklonskih protiteles v "sendviču" - sprememba zmanjša čas analize.
Raven protiteles proti tipa kolagen I in fibronektina lahko določimo s številnimi metodami: encimskim imunotestom immunofluorestsetgnym, metod raketa imunoelektroforezni in aglutinacije. Med njimi, ELISA metoda ima prednost v enostavnosti, dostopnosti uporabe, natančnost in zanesljivost. To je razlog, zakaj je večina rezultatov študij protiteles proti kolagena in fibronektina, spodaj, pridobljen z encimsko imunskim testom.
Da bi raziskali nivo protiteles proti tipa kolagen T, ter skupno fibronektin imunoreaktivnega vzorci krvi se izvaja v polipropilenskih cevi. Cevi za določanje fibronektin se doda 3,8% antikoagulant natrijev citrat pri razmerju krvi do antikoagulanta 1: 9 vol. trasilol dodamo v količini od 40 ED / mL do preprečili proteolitično cepitev fibronektina v raztopino antikoagulanta. Kri je treba takoj centrifugirali 15 minut pri 3000 obratih / min. Dobljeno serumu in plazmi se prenese na plastično EPPO Dorf, zamrznemo in shranimo pri TT-20 ° C Pred analize vzorca ne bi smeli odtajamo za preprečevanje fibronektina-C, ki je razgrajena molekula (Morrink s sod., 1985). Čas serumskih vzorcih vzorčenje in plazme pred izvedbo analiz ne sme biti daljši od 6 mesecev.
Protitelesa proti kolagena tipa I določimo z encimsko imunskim testom (ELISA) z nativno heterologno kolagena tipa I (Katsuyuki F. et Michiko T.).
Avtohtone vrste kolagena I se uporablja za imobilizacijo o polistirena plošče «Libro mase» družba (ZDA). Kolagen je uveden v vdolbinah pri 200 l na 0,01 M fosfatnega pufra pH 7,4. Plošče smo inkubirali 15-18 ur pri temperaturi t ± 4 ° C, nato pa večkrat izperemo z vodo iz pipe, ki vsebuje 0,05% th tajnim 20 in uvedemo vodnjakov, 200 ul vzorcev seruma razredčimo 1: 1000 v fosfatnim pufrom pH 7.2. Vzorce smo inkubirali v vdolbinah 30 minut pri t ± 37 ° C. Vdolbine enkrat izperemo kot zgoraj, in vsak od njih dodamo v 200 ml konjugata protiteles protivokollagenovyh peroksidazo v redčenje. Konjugat smo inkubirali 30 min pri st ± 37 ° C, po spiranju plošče v vsako vdolbino, da 200 litrov mešanice substrata, ki sestoji iz 0,0015% raztopino vodikovega peroksida in 0,01% m orthophenylenediamine v 0,05 M natrijevega citratnega pufra pH 4,7. Po inkubaciji 10 minut pri sobni temperaturi smo reakcijo prekinemo z dodatkom 50 ul na vdolbino 50% žveplene kisline. Intenzivnost barve zmesi substrata merimo pri valovni dolžini 492 nm.
Za primerjavo, se vzorec odvzame serumski bazen pridobljen iz 100 darovalcev. Rezultati so določeni s formulo:
A - Za / Tc • 100, kjer Tk - titer sravneniya- vzorca
Da - titer vzorca.
Skupna koncentracija v plazmi fibronektin se določi po postopku G. A. Ermolina preko ELISA v "sandvich- sprememb".
Kunčjega anti-humanega fibronektina uporablja za imobilizacijo na polistirenske plošče ( «Libro mase"). Protitelesa so narejeni v vrtinah v 200 ul 0,01 M karbonatnem pufru pH 9,6 (10 mg / ml proteina). Plošče smo inkubirali 15-18 ur pri 4 t
Standardna kalibracijska krivulja pripravimo z uporabo fibronektin, ki je razredčen z umeritvene krivulje s fosfatnim pufrom z 0,05% - m Tween 20 pH 7,2-7,4. Kot rezultat analize dobljenega niza umeritvenih krivulj zapiše koordinatami, pri čemer ekstinkcije vrednost - število fibronektina izbran linearni del standardne krivulje, ki obsega naslednje količine fibronektina: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 nm / ml. Vsebnost fibronektina v testnih vzorcih krvne plazme s standardno umeritveno krivuljo določi. Standardna fibronektin redčenje za sestavo kalibracijske krivulje, pripravljene za vsako ploščo.
Fiziološko fibronektin molekulo plazme sposoben vezave za izvajanje svoje opsonic aktivnost samo, če obstaja vsaj en prosti plavžni na kolagen (EngvaJl E. et al, 1977). Tako se fibronektin molekula domeno 2 - eno v vsaki podenoti (D&rsquo-Ardenne A. et al., 1984). Tako je z določitvijo ravni celotne plazemske fibronektina je nemogoče z gotovostjo sodnika funkcionalna aktivnost njenih molekul, saj je reakcija zazna temelji na določitvi epitopov vrst.
Dan določitev imunoreaktivnih plazme fibronektina ELISA uporabimo modifikacijo ,, kjer v polistirenske plošče imobilizirano protitelo ni tako "sendvič-metoda", in 1% - te raztopine želatine, ki veže fibronektin preko kolagenska področjih. Tako, da se preveri tableto z fibronektina molekulo želatina plazmi odzivajo le na trdni fazi, ki ima prosto domeno, "lepljiv" na kolagen. Kot standard se uporablja sveže plazme zdravih darovalcev z znano vsebnostjo celotnega plazemskega fibronektin. Izračun vsebnosti imunoreaktivnih plazmi fibronektina v vzorcih izračunamo na naslednji način:
K = 1 - (x - N / x), pri čemer je K - število imunoreaktivnih plazmi fibronektina izražena v poljubnih običajnih enot
x - Gasilni obraztsa-
N - Gasilni darovalca plazmi.