Molekularna genetska diagnostika

Video: Molekularna genetska diagnoza bolezni. Kje je meja naše možnosti?

Ločeno gen ali krajše segmente DNA ni bila vizualiziramo pod mikroskopskim pregledom, pa se uporablja za identifikacijo mutacije z molekularno genetske diagnostike. Informacije, pridobljene iz "Human Genome Project", in drugih napredek v molekularni genetiki so se močno razširili zmogljivosti vnaprej ali postnatalni diagnozo genetske bolezni. Metode genskega diagnozo zgodnje odkrivanje in prognozo mono- in poligensko bolezni prvenec v odrasli dobi. Tehnične zmogljivosti molekularne genetske diagnostike lahko presegajo etičnih meja, ki jo dednih bolezni, še posebej, če bi bilo treba te študije, izvedene v otroštvu in adolescenci.

Video: Mikhailenko DS - Sodobna molekularna genetska diagnostika v urologiji

Metode molekularne citogenetiko

Količinske in strukturne nepravilnosti kromosomov - pogosti vzroki številnih razvojnih napak in rakom. Določitev teh kromosomskih aberacij je pomembno družinsko svetovanje za prognozo in reproduktivnega tveganja v prihodnje nosečnosti. Tradicionalni kromosom analiza - za "zlati standard" za citogenetskih diagnostiko, vendar ima omejeno kapaciteto. Metode genskega diagnostiko z uporabo fluorescenčnih nalepk, ki temeljijo na kloniranja tehnologije in povečano občutljivost protiteles konjugatov lažjo identifikacijo subtilnih sprememb kromosomskih s klasičnim citogenetsko študiji ne zazna. Take tehnike izboljšanje diagnostičnih zmogljivosti pri preučevanju otroke z duševno prizadetih, v duševnem razvoju in številnih drugih bolezni.

Video: The Borovlyany odkrili molekularno genetsko laboratorij

Fluorescentno in situ postopku hibridizacije

fluorescenčna hibridizacija in situ (FISH - fluorescentno in situ hibridizacijo) vključuje uporabo edinstvenega nukleotidnih zaporedij DNA kot sondo izbiro specifičnih zaporedij DNA iz materiala, dobljene iz pacienta. Lokusspetsifichesky ali genspetsifichesky DNA sonda označena z posebno marker (npr fluorokromom), da se omogoči njegovo odkrivanje s fluorescenčno mikroskopijo. Raziskovanje DNK je pripravek kromosomska za mikroskopskim pregledom, ki obsega navoj metafazo in pri medfaznih jeder (v ne delijo stanju). DNA sonda in tarčno DNA je denaturiran, kar vodi do tvorbe enoverižno DNA. Sonda DNA dodamo k pripravi kromosomu, in inkubiramo zadosti časa za hibridizacijo sonde DNA in komplementarnih sekvenc DNA pacienta, če ima pacient odsek DNA komplementarno sondo DNA. Hibridizacija pojavi le na regije komplementarne DNK in ne zadeva fragmente z drugimi zaporedja DNK iz drugih delov genoma. Prisotnost ali odsotnost sondo-fluorokromnega označene jo sestavljajo DNA po hibridizaciji v študiji kromosoma s fluorescenčno mikroskopijo. Rezultat te metode molekularna genetska diagnostika kot pravilo, je nedvomna.

Video: Genetika in prehrana

Prednosti metode molekularne genetske diagnostike FISH vključuje hitro analizo velikega števila celic, visoko občutljivostjo in specifičnostjo, sposobnost razišče niso culturable in ne delijo celice. S to metodo je mogoče raziskati celice, vsebovane v oddelkih parafina. Slabosti so, da je nemogoče dobiti informacije o fizičnem stanju ciljne DNA ali kromosomov regiji. Izvajanje FISH zahteva lokusa znanja vključeni v kromosomsko aberacijo, in izbiro primernega sonde DNA, ki lahko zazna ta aberacije. FISH ne uporablja kot presejalno metodo molekularne genetske diagnostike. Metoda se uporablja, da bi dobili odgovor na določeno vprašanje (za ugotavljanje prisotnosti ali odsotnosti domnevne specifične mutacije). Značilno je, da dopolnjuje klasične metode za obarvanje kromosomov, in je primarni sredstvi za identifikacijo kromosomov v metafazo ali interfazi in specifičnih nukleotidnih zaporedij DNA, ki so osnova določeno bolezen (fenotip).

FISH uporabljamo prenatalno molekularno genetsko diagnostiko ter za označitev njene opuholey- pediatrično uporabo, običajno, da prepoznajo Izredno majhnih izbris, povezanih z določenimi deformacij. Sindromi, ki temeljijo na microdeletions, ko šteje bolezen neznane etiologije, kot kromosomske izbrise in prilagoditve, ki povzročajo razvoj teh bolezni se običajno ne postanejo tradicionalne metode analize kromosomov. Takšne majhne izbrisi v določenih kromosomskih regijah je mogoče identificirati z visoko natančnostjo, ki ga FISH. Za bolezni, ki jih Izredno majhnih delecije, vključujejo Prader-Willijev sindrom, Angelman, Williams, Miller-Dieker Smith Madzhenis in sindrom velokardiofatsialny. FISH omogoča diagnozo teh sindrome v nenavadnih okoliščinah, še posebno v otroštvu, ko ni veliko diagnostično pomembnih znakov bolezni. Uporaba te metode molekularne genetske diagnostike je tudi priporočljivo, v adolescenci in odrasli dobi, ko so značilni klinični znaki bolezni, ki so specifični za otroštva, se spreminja.

Subtelomericheskie reshuffle

V večini primerov je translokacije vključuje koncih kromosomov (telomeres). Veliko število genov, ki so osnova za dedne sindrome se kažejo v obliki malformacij, lokalizirana v regijah, ki mejijo na telomeres v kromosomih subtelomericheskih področjih. Presejanje telomere, da prepoznajo kromosomske preureditve je dober način za identifikacijo Izredno majhnih kromosomskih mutacij in preureditve ni zaznati s standardno analizo kromosomov. FISH, ki se uporablja za odkrivanje Izredno majhnih kromosomskih prerazporeditev pri bolnikih z duševno zaostalostjo, se osredotoča na prepoznavanje mutacij, ki se nahajajo na nenormalne kromosomskih konci subtelomericheskie odkrijejo pri približno 7,5% teh bolnikov.

Primerjalna genomske hibridizacije

Primerjalna genomsko hibridizacijo (CGH) - je uporaba metode FISH za genom presejanje širok ugotoviti razlike v številu kopij kateremkoli izmed nukleotidnih zaporedij DNA pri pacientu. CHS je bil razvit za genetske študije na področju onkologije (primarni solidnimi tumorji), vendar se sedaj uporablja za določanje lokalizacijo genskega materiala ali prekomerne izgube kromosomskih regij z domnevno kromosomske nepravilnosti. Ta metoda molekularna genetska diagnostika obsega mešanje in sočasno hibridizacijo enakih količin različnih barv testiranih označeni DNA (npr označeni z zelenim fluorescentnim barvilom) in normalno referenčno DNA (npr rdeča fluorescentno barvilo) z običajnimi filamentov v metafazo. Rezultat je določeno razmerje med zelene in rdeče fluorescence. V tem testu sta pomnoževanje DNA področje (multipla kopiranje) zaznana kot območja prekomerne koncentracije zeleno barvo odlagalne cone - tako področjih, rdeče odsevnih testno pomanjkljivost DNA in enako razmerje testa in normalne DNK so področje rumene barve. Tako CHS zagotavlja zemljevid DNK nukleotidnih zaporedij v genomu. Prednosti te metode je molekulska genetska diagnoza je možnost njegove uporabe v vsakem tkivu. Metoda ne more zaznati uravnotežene kromosomske nenormalnosti, v katerih se je število kopij DNK ne spreminja. Resolucija metode ne omogoča ugotoviti kromosomsko kopijo z velikostjo manjšo od 10 MB in spreminja število kopije, če izguba kromosomov ali kromosomsko presežni material vsebuje manj kot 50% analiziranih celic.

Spektralna kariotip in multicolor FISH

Omejitev CHS zmogljivosti pri prepoznavanju uravnotežene kromosomske preureditve je napolnjena z večbarvne barvanje kromosomov z enim hibridizacijo. Spektralne kariotip in Multicolor FISH (M-FISH) - povezane metode molekularno genetske analize, ki so sposobni prepoznati uravnotežene kromosomske preureditve. V obeh metod, molekularna genetska diagnostika, vsak izmed kromosomov v metafazo označeno posebno barvo, ki lahko hkrati viden celoten niz kromosomov. Kromosom 24 je sonda označena z fluorokromom in 5 se uporablja v kombinaciji, ki vodi do nastanka kombinatornih vezja, pri čemer je vsaka od 22 autosomes kot tudi X- in Y-kromosoma pobarvane v različnih barvah. M-FISH zahteva uporabo posebnih sklopov filtrov za vsako od 5 flyuorohromov- po spektralnem kariotip uporablja spektroskopijo in interferometra za ocenjevanje vzorcev emisij fluorescenco. Te metode omogočajo, da razkrije zapletene kromosomske preureditve, majhen translokacijo kromosomov in označeni. Slabosti metode vključujejo nezmožnost za prepoznavanje majhnih izbris ali podvajanja intrahromosomnye in pericentric ali paracentričen prevrne.

Analiza DNK Metode

Molekularna citogenetski metode povečanje diagnostične zmogljivosti za odkrivanje kromosomskih izbrisov ali podvajanj (vsebujejo več deset ali več sto genov). Druge metode analize DNK lahko ugotovijo spremembe v posameznih genov. Izvajanje analizo DNA je mogoče v zvezi z dejstvom, da DNK - je relativno stabilna molekula, ki jih lahko izoliramo iz vseh celic z jedri in shranili za nadaljnjih študij. Najpogosteje izoliran iz DNA leykotsitov- drugih materialov, ki se uporabljajo v ta namen vključujejo amnijske celice in horionskega resic (s prenatalno diagnostiko), celice, pridobljene iz kapi s lično sluznico in fibroblaste, pridobljenih iz biopsijo kože. Ko je ograja ta tkiva navadno mogoče izolirati zadostno količino DNA. Sodobne metode molekularne genetske diagnostike, kot verižne reakcije s polimerazo (PCR) omogoča pomnoževanje DNA, dobljene iz vsega ene ali več celic.

Južna, Western, Northern blot

Southern blot analizo - to je prva metoda molekularne genetske diagnostike na molekularnem nivoju. Zdaj je v veliki meri izpodrinili metode, ki temeljijo na PCR, in neposredno zaporedje DNK. S Southern blot analizo, genomsko DNA, izolirano pacienta in ga narežemo na majhne fragmentov z uporabo restrikcijskimi endonukleazami (bakterijskih encimov, ki cepijo DNA na določenih mestih nujno). Dobljene fragmente ločimo glede na velikost uporabo elektroforezo na agaroznem gelu, preneseno preko blot na najlonsko filter stabilno pritrjeno na filtru smo hibridizacija izvedena s sondo z radioaktivno označenim DNA, čemur sledi avtoradiografijo. Ta metoda molekulyano genska diagnstiki omogoča odkrivanje mutacij, če se spreminjajo dolžino fragmenta DNA (restrikcijsko mesto), ki spreminja sliko nastalega encimatske cepitve. Southern blot še vedno najbolj pogosto uporabljajo za odkrivanje oprijema gena s posebnim prirojeno polimorfizma DNA. Možno je tudi, da bi izsledil širjenje gena v drugih družinskih članov, tudi če je specifična molekularna napaka povezana z dedno boleznijo, ni mogoče identificirati.

Ko Northern blot analizira strukturo in količino mRNA Produkcija poseben gen. RNA cepitev z omejevalnimi encimi nemogoče. Kopije RNA različnih dolžin, odvisno od velikosti in števila eksonov v genu. Tako lahko mutacije, ki spremenijo znesek ali dolžine eksonov določi kot posledica sprememb v RNA z Northern blot odkrite. Metodologija je enaka Southern blot, z izjemo, da se celice proučili celotne RNK ali očiščen mRNA namesto DNA cepi z restrikcijskimi encimi.

Western blot analizo vsebuje informacije o velikosti in števila mutiranih proteinov v celičnih ekstraktov, dobljenih iz bolnikov s posebnimi genetskih bolezni. Proteini iz celičnih ekstraktov smo ločili po velikosti z elektroforezo na poliakrilamidnem gelu in prenesli na membrano. Trak je nato inkubiramo s specifičnimi protitelesi na proteine. Sekundarna protitelesa (usmerjena proti prvemu protitelesa) označeni s fluorescentnim barvilom Ta metoda molekularne genetska diagnostika se uporablja za določanje prisotnosti ali odsotnosti in velikost proteina distrofinske mišic pri bolnikih s-X povezana mišična distrofija.

Verižna reakcija s polimerazo

Čeprav je pri nekaterih boleznih večina mutacij pojavijo kot posledica velikega izbris DNK, ki se je pokazala s Southernu, večina nepravilnosti genov, ki so osnova za številne bolezni so točkovne mutacije. Po detektiranje točkovno mutacijo lahko sinteze DNA konstrukt (primerjev), ki zajema kratek odsek prizadeti mutacijo. Kako dovolj kopij spremenjene DNK je lahko težavno, vendar PCR zagotavlja več kopij posameznih fragmentov DNK. Pri PCR pomnoževanje DNA izvajajo ponavljajoče termičnih ciklov. PCR je revolucionarno diagnozo mutacij. To je zelo standardiziran in avtomatizirano metodo molekularne genetske diagnostike, ki se lahko opravi na majhnem številu vzorcev. Postopek je relativno poceni, za nekaj ur mogoče dobiti milijard kopij določenih DNK nukleotidnih zaporedij.

Neposredno zaporedja DNK

Avtomatizirano DNA sekvenciranje je postal standardna metoda molekularne genetske diagnostike v mnogih kliničnih laboratorijih molekularne genetike in prispevala znaten napredek "Human projekta genom". Zaporedja DNK je še posebej uporabno v primerih manjših genov in v primerih, ko je točna mutacija v tej družini ni znan. Vse ugotovljene spremembe v strukturi gena je treba skrbno analizirati, da vidim, ali so osnova bolezni, ali se nanašajo na normalno polimorfizma.