Primeri laserskih fluorescentnih diagnostike - laserski diagnostika v biologiji in medicini

Primeri laserjem
fluorescence diagnozo v medicini
Rak diagnostika. Dosedanje izkušnje je zdravljenje raka daje razlog za domnevo, da bi zgodnje rak diagnoza, sledi kirurško ali terapevtsko (morda laserski) zdravljenje bistveno poveča verjetnost okrevanja. V zvezi s tem, so različni raziskovalni centri, vključno s tistimi v naši državi, iskanje novih in bolj učinkovitih diagnostičnih metod. Preden je bilo ugotovljeno, da uporaba laserjev da fluorescenco spektri v vidnem območju pridobljeni iz normalnih in tumorskih tkiv razlikujejo. Uporaba laser fluorescentne spektrometre z visoko spektralno gostoto moči morebitne vzbujanja bi povečali hitrost in kakovost pridobitev spektrov in dvigniti splošno raven raziskav v tej smeri.
Sl. 7.3 prikazuje fluorescence spektre dobljene iz normalnih in tumorskih ledvic in prostate podganah [12, 13]. Razvidno je, da je glavna maksimuma od spektri tumorskega tkiva (A = 521-522 nm) odmaknjen za modro območju v primerjavi z zdravim (A = 531-533 nm). In zelo oblika spektri bistveno drugačen. Te razlike v fluorescenčno spektrih, očitno je, da je treba upoštevati pri preučevanju človeških tkiv in organov. Te razlike so posledica sprememb v okolju in okoliških fluorofori ali proizvodnjo novih fluorofori induciranih biokemične spremembe v celicah ali v svojem okolju. V območju valovnih dolžin je A = 520-530 nm flavins fluorescirajo, fluorescenca spektri maksimuma sta nekoliko premakne glede na okoljske pogoje. Torej, če ne govorimo o proizvodnji novih fluorofori, je mogoče domnevati, da je v tem primeru fluorescirajo flavins. Splošni vrhovi v spektrih v regiji = lahko 590-640 nm pripišemo porfirinov vsebuje mitohondrijski citokroma. Njihova fluorescence se poveča pri odstranjevanju Fe in Cu ionov.

Sl. 7.3. Fluorescenco spektri ledvic (-ov) in prostate (b) podgana: 1 - zdravo telo, 2 - tumorja

Sl. 7.4. Shema laserskega fluorimeter: 1 - Ar laser, 2 - helikopter 3 - objekt 4 - sistem ostrenja, 5 - monokromatorjem 6 - PMT, 7 - ojačevalnik 8 - snemalnik [121

Shema za namestitev v katerih so bili dobljeni spektri zgoraj so prikazani na sl. 7.4. Stalno sevanje Ar laser (= 488 nm), ki jo je helikopter s frekvenco 200 Hz, s poudarkom na površino tkiva moduliran. Fluorescentna signal, ki uporablja sistem leč usmerjena na vstopno režo dvojnega monokromatorja, ki opravi skeniranje spektra z ločljivostjo DL = 1,8 nm v območju od 800 nm = 500, tako da je razpršena svetloba pada na fotopomnoževalko. PMT signalov sinhrono s helikopterjem ojača in zapiše na snemalnik. Sonda laserska moč je 100 mW, sevanje, premer lokaciji v merjenje - 100 mikronov. V spektre smo posneli večkrat, in hkrati so opazili popolno ponovljivost.
Upoštevajte, kot sedmih, da se ista sredstva lahko uporabimo za diagnosticiranje zobnega kariesa. Izkazalo se je, da obstajajo znatne razlike v fluorescence spektrov in elastično sipanje v vidnem območju karijesne in zdrave območjih zob. Več informacij najdete zainteresirani bralec v [14].
Druga obetavna Postopek laserske fluorescence diagnozi raka, ki temelji na sposobnosti malignih celic in tkiv kopičijo povečana v primerjavi z normalnimi celicami in koncentracij tkiva fluorescenčnih barvil [15, str 36]. Izvajanje optični pregled tkiv v spektralnem območju od fluorescence barvila omogoča hitro zaznavanje položi svojo večjo koncentracijo in posledično tumorske lokalizacije.
Uporaba laserjev na ta način, je bistvenega pomena ne le z vidika nujnosti visoke spektralne gostote moči sevanja, ampak tudi z vidika potrebe po uporabi optičnih poti za dovajanje vzbujanja sevanja na notranjih organov in izpušnih fluorescence tega.
Izbira optimalne barvila za fluorescenčno diagnozo tumorjev se izvede v skladu s številnimi zahtevami. Barvila morajo biti označena: visoka selektivnost akumulacije v malignih celic in tkiv (v primerjavi z normalnimi), visoko kvantni dobitkom fluorescence, hitrega izločanja iz telesa, pomanjkanje neželenih učinkov na tkiva in organizma kot celote. Ne sme biti visoka quantum dobitek singlet generacije kisika fotoinduciranega ali katera koli druga sredstva tsigotoksicheskih razliko nasprotnih zahtevah za barvilih za foto dinamično zdravljenju tumorjev.
Trenutno laboratoriji razvijajo tehniko laserskega fluorescence diagnozo raka, se pogosto uporabljajo kot barvila hematoporfirina (HP) hematoporfirina derivata (HPD) [P. 36, 16, 171 in flyurenat (fluoresceina dinatrijeva sol) [15, 18]. Medtem ko sta prvi dve barvila uporabljajo tudi za fotodinamične terapije flyurenat je bolj primerno za diagnozo. Tako nudi kontrast na opazovanje tumorja fluorescenčno svetlobo o ozadju normalnega tkiva ni manjša od 50: 1, v primerjavi s 5: 1 v GWP.
Za vzbujanje fluorescence flyurenata najprimernejša sevanje št - Cd laserski (A = 441,6 nm), ki spada v njegov absorpcijski pas. V prisotnosti bolnika, se uvede kri flyurenat, maligne tumorje, kot gastrointestinalnem traktu, tumor sveti svetlo zelena luč na temno modrem ozadju neprizadeti sluznico. To luminiscenco z gotovostjo 98% ustreza lokacijo tumorja. Nekrotično tkivo daje brez svetlobne odseke. Taka območja so pogosto opazili pri velikih tumorjev, ki žarijo šibkejši na splošno.
V nekaterih primerih je površina emisije z laserskim vzbujanja je bistveno višja od tumorja, vidno pri normalnih svetlobnih pogojih. To pomeni visoko infiltracijo rakasto tkivo v steni telesa. Ta ugotovitev nam omogoča, da pravilno načrtovati operacijo.
Metastaze so osvetljeni, kot tudi tumorji. Uporaba fluorescence diagnoze bistveno poveča delež njihove identifikacije. V nekaterih primerih, samo z fluorescence v obliki znotraj organov metastaze proso izpuščaj stran od tumorja.
Zanimivo je omeniti, razpoložljivo prakso v primerih [15], kakor pri bolnikih z diagnozo raka, kot je debelo črevo, ki ga je določil otip in rentgenske smo opazili fluorescentno svetlobo. Tudi med operacijo diagnoza rak ni dvoma. Vendar pa je nadaljnje histološke preiskava ni potrdila to diagnozo: vnetni infiltrati so zamenjati za tumor. Ega kaže visoko zanesljivost laserske fluorescence diagnostiko.
Trenutno se delo nadaljuje na kliničnem preskušanju te metode in za preučevanje mehanizmov selektivne akumulacije barvil v rakavih celic [17, 19], pa tudi za študij mehanizmov fotodinamične škode biomolekul, celic in tkiv bioloških struktur [20, 211. Pomemben korak v tem delu je študija stacionarne in časovno rešiti fluorescenčni spekter barv v rešitev in živih celic se izvaja s pomočjo laserskih spektrometri za pikosekunde in microspectrofluorometers.
V [22, 23] smo zabeležili fluorescentne spektre GP, GP diacetat (BPH) in digematoporfirinefira (Photofrin 2) v vodnih raztopinah (pH = 4,0-11,0) v fosfatnim pufrom (pu = 7,4) in v dimetilformamidu raztopini v modelnih sistemih: umetni lipidni vezikli - liposome in eritrocitne sence, kot tudi v kultiviranih prašič ledvičnih celic in človeških fibroblastih.
Instalacijska shema na katerega se pridobi spektre, ki je prikazana na sl. 7.5.

Sl. 7.5. Shema pikosekunde fluorescenčni mikroskop: 1 - jasno usmerjanje leča 2 - objekt 3 - monokromatorjem 4 - PMT 5 - fotonov števec, 6 - mikroračunalnik [22]
Fluorescenco smo vzbujanjem z ločenima impulzi ali drugo harmonično YAG: nd laser, laser z barvilom pulzni dolžini 70 ± 10 ps. Kratek met objektiv osredotočila vzbujanja laserskega žarka do objekta in zbranih fluorescence. Premer snopa v območju zaznavanja bil manjši od 1 um. Fluorescentna svetloba usmerjena prek

transparentno v območju 600-700 nm paraboličnim zrcalom na monokromatorja in nadalje na način delovanja photomultiplier fogonov računu. Celoten sistem deluje pod nadzorom mikro-računalnik.
V celicah glavnega največ fluorescenčno spektra pade na 635 nm. Stacionarni spektre ima vrhove pri 612 nm za vodne raztopine pri 625 nm in -

Sl. 7.6. Porazdelitev intenziteta fluorescence človeških rakavih celic, občutljivi GWP [25]
organsko topilo. To kaže, da je narava fluorescence molekulami barvne snovi v glavnem odvisni od svojega neposrednega okolja (molekul vode, topila in drugih lipidov.).
Kinetične meritve so pokazale, da je narava fluorescence razpada odvisen od barve molekul v obliki monomerov ali do njene združevanje in kompleksa z drugimi takimi znotrajceličnih struktur. Tako fluorescence kinetiko upadanja je GP monomera v vodni raztopini v območju največje simulirano z dobro natančnost po enojna eksponentno s časom t = 15-16 ne. Pojav agregatov v raztopini (oligomere) barvila za posledico nastanek še "hitro" eksponentno s t = 0,5 ns. Hitro kinetika pojavi tudi v traku glavnega največ fluorescenčno spektrov molekulami barvne snovi v celicah, kar kaže, da so te molekule tvorijo komplekse z znotrajceličnih struktur verjetno membrane.
S povečanjem odmerka izpostavitvi svetlobi raztopine barvanje imajo stabilne fotoproizvodom ki v svoji kinetične in stacionarni stranskih bokov fluorescence spektri s pikosekunde razpada (za GP? .tah = 644 nm, T = 100 ps) [24]. Sl. 7.6 prikazuje primer merjenje razporeditve intenzitete fluorescence celice raka človeškega po 1-urnem vsebine njegove raztopine GWP [25]. Koncentracija Barvilo je bila 50 g / cm3, gostota moči sevanja izvedeni argonskim laserjem na celični površini - približno 0,4 mW / cm2. Razmerje signal / šum je v regiji več deset maksimalne fluorescence. Meritve so bile opravljene na laser fluorescenčni mikroskop, opremljen z visoko občutljiv sistem za zaznavanje, digitalno obdelavo in predstavitev slik.
Razvidno je, da je intenziteta fluorescence v osrednjem območju manjša kot v obrobnih območjih. Ta rezultat pomeni, da GWP kopiči predvsem v zunanji membrani kultiviranih rakavih celic, ki se ujema z rezultati drugih avtorjev [26]. Glede na to dejstvo, kot tudi prikaz na kompleksne molekule barvila proti membrane, je mogoče domnevati, da uničenje rakavih celic v foto-dinamično zdravljenju tumorjev razvije predvsem v celičnih membranah.
Na tej sliki, minimalne velikosti slikovni element območja ustrezajo 0,25 mm o predmetu, ki je na robu prostorsko ločljivostjo optičnega sistema. Čas pridobitev fluorescenčne slike je 1 je v nasprotju z nekaj deset sekund, zahtevanih s klasično umetnostjo, poleg tega daje premalo prostorske ločljivosti.
Vsako leto povečuje število del na področju razvoja in testiranja laserske fluorescence diagnozo malignih obolenj tehnik nam omogoča, da upam, da v bližnji prihodnosti, te tehnike skupaj z lasersko terapijo, rak Fotodinamična zavzame trdno mesto v ambulantah.
Diagnozo miokardno ishemijo. Mnogi fluorometrični študija živih celic, ki temeljijo na odkrivanje razmerje koncentracije reduciranih in oksidiranih oblik piridin-nukleotidov [NADH] / [NAD +], je koencim številnih znotrajceličnih reakcij. Ta odnos nosi pomembne informacije o stanju celic in sestavljena iz tkiv in organov. Sposobnost registracija fluorescenca opredeljujejo lastnosti NADH absorbirajo svetlobo pri valovni dolžini Xi = 340 nm in vrhunec fluorescenca maksimalno valovno dolžino A2 = 480 nm. NAD + pri valovni dolžini ne absorbira in njegova fluorescenca na področju R2 je precej manjša.
Zanimiv primer tega pristopa je registracija miokardno ishemijo v normalnih fizioloških pogojih [13]. Značilnost krvnih škropili organov

Sl. 7.7. Shema laserskega optic fluorometer [13]
To je močan perturbacija uveden v fluorescenčno signalom tkiva krvnega obtoka. Za izravnavo tega motenj je bilo mogoče s hkratnim snemanjem intenzitete fluorescence od valovne dolžine in intenzitete odbitega sevanja tkanino pri najvišji absorpcijski pas hemoglobina (R3 = 805 nm).
4on Sl. 7.7 je diagram vlaken laserskega fluorometru ustvarjeno za take meritve. Naprava obsega dva laserja: dušik (/) in barvilo (2), kot vir UV in IR sevanja, dva fotodiode (3), razmerje beleženje izhodne moči laserjev, dve PMTs (4) za merjenje intenzitete fluorescence z UV-sevanjem induciran in intenzivnost odbitega infrardečega sevanja. To vezje, seveda, opremljen z elektronsko enoto in mikroračunalnik. dušikov laser parametri: ponavljanja impulzov 140 Hz, energija na impulz 150 mJ, maksimalna moč 30 kW, povprečna moč pri izhodu ponavljalno frekvenco 100 Hz -

mW. trajanje laserskega impulza barvila na isti ponavljalno frekvenco - 6 št.
Kot ponazoritev posledica uporabe Opisana naprava za snemanje srčne mišice ishemije pri sl. 7.8 prikazuje časovno odvisnost intenzitete odbite svetlobe (/) in fluorescence (2) med ishemične kapi (stop perfuzija) izoliramo škropili podgana srčnega modela. Zmanjšanje razmislek

Sl. 7.8. Kinetika spreminjanja refleksije (1) in fluorescence ob napadu ishemijo inducirane srčni zastoj krysy_ perfuzije (čas TX), (2) in se je nadaljevala po 50 sekundah (čas t2)
To se zgodi z zmanjšanjem koncentracije intersticijskih rdečih krvnih celic, medtem ko je povečanje intenzitete fluorescence zaradi povečanja intracelularni razmerje [NADH] / [NAD +].
fluorometer laser vlaken se lahko uspešno uporablja pri operacijah na srcu, da preuči metabolizem srčne mišice skozi kateter svetlobno-vodenje. Poleg tega je očitno, da lahko kateri koli organ, ki je na voljo za fibroskopom ali kateter biti predmet študija s tako fluorometru. Upoštevajte, da nonlaser fluorimeter, že zgrajena na osnovi živega srebra svetilko, ki monokromatorja, filtri in UV mikroskopom, nisem omogočajo pridobiti zanesljive rezultate, predvsem zaradi pomanjkanja občutljivosti.
Diagnoza ateroskleroze. Še ena obetavna uporaba fluorescence diagnostiko v medicini postaja diagnozo aterosklerotičnih plakov in še zlasti vlaknatih plakov, ki so v prvi fazi aterosklerotičnih žilnih lezij.
Kot je prikazano v [26], lahko prisotnost aterosklerotičnega plaka v posodi se določi s primerjavo intenzitete fluorescence pri valovnih dolžinah 580 in 600 nm z vzbujanjem pri 480 nm. Sl. 7,9

Sl. 7.9. Fluorescenco spektri normalno (/) in aterosklerotične (2) arterije [26]
To kaže karakterističen fluorescence spektri dobljenega iz običajnega in aterosklerotičnih arterije. Razvidno je, da so zelo različni.
Z dejstvom, da je višina vrha pri 600 nm glede na minimum, ki se nanaša na 580 nm veliko večja v primeru zdravih arterij, glede na poraz, lahko kontrastno razmerje / (600) // (580). Pomen tega odnosa, pridobljenih v poskusih potrdili ustreznih histološko analizo, je približno 2 do približno normalne arterije in aterosklerozne 1.
Številni poskusi kažejo, da lahko zanesljivo ločiti med normalnim arterije in arterije zobnih oblog z debelino 0,5 mm ali več. In čeprav se doslej lahko doseženi le na trupla arterijah rezultate, računajo na neposredno laserskih diagnostiko ateroskleroze in vivo skozi kateter svetlobno-vodenje bo kmalu postalo mogoče. V primeru pozitivnega diagnoze lahko na isti kateter za prenos visoke odmerke laserskega sevanja v lezije ateroskleroze, da bi uničili plošče.