Uporaba Raman spektroskopijo v biokemijskih študijah - laserski diagnostika v biologiji in medicini

6.2 Uporaba Raman spektroskopijo
v biokemijskih študijah
Študija proteinov. Klasični predmeti za uporabo Raman spektroskopijo do biomolekul so proteini in njihovi sestavni deli. Poleg tega, če so prva Raman spektre proteinov pridobljen konec 50-ih do svetilk, v zadnjih dveh desetletjih, kot je uporabljen vir vzbujanja izključno laserji.
Cilj večini raziskav izvedena metodami KR je študij molekulske strukture in proučevanje funkcionalnih skupinah ugotovimo njihovo biokemijsko aktivnost [9, 10].
Iz konvencionalni (SPONTANO) ramanski spekter proteina lahko pridobi informacije o njegovih strukturnih značilnosti, kot je povprečni primarni polipeptidne verige konformacijo [P. 8]. Zlasti se ta informacija vsebuje položaju in obrisom traku 1 in amid-amid-3. Dejansko vsak amidna skupina v molekuli proteina ima amidni intenzivno linijo 1, katerega položaj v spektru odvisen od konformacije tega dela molekule. Večina skupin amida v sestavku, npr a-vijačno obliko podvržen približno enak vpliv iz sosednjih atomov in ima zato približno enako frekvenco vrstica-amid (cm-1 1645- 1657). 1
Amid skupine sestavljene iz (3-strukturni fragment molekule nekoliko drugačno frekvenco tej vrstici (1665-1672 cm-1). Ker realno sekundarni strukturi beljakovinske molekule kompleksa, ugotovljen na Raman spektra tega proteina pasu amida 1 predstavlja superpozicija posameznih linij.
Enako velja za pasovnorobne amid 3, ki se pojavljajo v različni meri linij: 1260-1295 cm1 (šibko), 1230- 1240 cm-1 (močno), in 1245 ± 3 cm-1 (širok) nanašata ka vijačni, (5-strukturne in neurejene konformacije.
To kaže, da, (npr glasbenega širi eksperimentalno spektre pa ločene strukture), je z analizo obliko in položaj največjega profila pasu mogoče pridobiti kvantitativno ovrednotenje vsebnosti posameznih vrst struktur testne beljakovine.
Obsežno gradivo nabrali do sedaj vzpostavitev sekundarne strukture različnih proteinov, v veliki meri temelji na študiju Raman spektra polipeptidov znano zgradbo modela [9, P. 8].
Mi dokazati možnosti Raman spektroskopijo v študiji konformacije proteinov in polipeptidov v vodni raztopini in v trdnem agregatnem stanju v primeru študiju strukture in interakcijo C-proteina in miozin [11]. Ti proteini z molekulsko maso 140 OOO in 460.000, v tem zaporedju, smo izolirali iz kunčjega skeletnih mišic. Sipanja vzbujani Ar laser (Ji = 488,0 nm), se evidentiranje izvedemo z ločljivostjo 5 cm-1.
Sl. 6.4 prikazuje Ramanov spekter v C-proteinu, miozin in kompleksa. Za spekter C proteina (sl. 6.4a) amid značilna močna line-1 (1668 cm -1) in relativno dobro opredeljeno pas amida 3 (1242 cm -1). Tak položaj njihov delež označuje, da so proteinski konformacije molekule C p-naključni klobčič strukture in v približno enakem razmerju.
Za miozin (sl. 6.46) je označena s šibkim sipanja črto v amid-3, medtem ko se tresenje kaže amid 1 vztrajati 1653 cm-1. Obstaja tudi velika vrv 939 cm-1, ki ustreza vzdolžni vibracij glavnega molekule polipeptidne verige. To kaže, da je večina miozin molekul v a-vijačnice mesnatosti in majhen del njih - v | $ -structures mesnatosti.
V tvorbo kompleksa miozin - so Ci-beljakovinske molekule vezan na slednjo miozin molekule na več mestih, zlasti na lahke verige in HMM v subfragment 2-rep molekule. Takšna interakcija se zdi, da bi lahko imela pomemben vpliv na obeh konformacijo molekule. Vendar analiza Raman spekter kompleksa (sl. 6.4v) kaže, da so konformacijske spremembe molekule ne pride v vodni raztopini ali v trdnem stanju.

Sl. 6.4. Ramanski spekter a - C-proteinu (3% -na raztopina), b - miozinska beljakovine (6% tablete), ki je - miozinska kompleks - C protein (6% tablete). Meritve smo izvedli pod enakimi pogoji: v prisotnosti 0,09 mola KC1 in 5 * 10&ldquo-3 mol K3PO4
<оН=7,0) [11]
Z uporabo metode RRC, lahko v mnogih primerih preuči posamezne atomske skupine in njihove funkcije v biomolekule. Tako resonančna CURS izvedba uporablja za preučevanje kompleksne molekule P-karotena, vitamina Bi », metalloporphyrin [12]. Zanimivo je študij medsebojnega delovanja koencim flavinadenindinukleotid je (FAD) iz encimskega proteina glukozna oksidaza [13, 14]. Zanimiva lastnost teh poskusov je, da je največja absorpcija pas FAD dobi anti-Stokes valovno dolžino signala, ne pa valovna dolžina sevanja črpalke. V primeru, kjer je resonančna valovni dolžini črpalke, je kakovost dobljenega spektrov drastično poslabšala. V [14] eksperimentalno potrdili prisotnost vodikove vezi FAD - encim.
Upoštevajte primer podrobneje študijah ASR mehanizma belka- katalitske aktivnosti encima a-kimotripsin [15-17]. Aktivno mesto molekule vsebuje imidazolno skupino Gis57 ostanek z vodikovimi vezmi povezan z ostanki Asp 102 in Ser 195, pri čemer se tvori sistem pretoka naboja. Sposobnost podroben opis postopka pojavlja v aktivno mesto a-kemotripsina, pomeni, da so informacije o stopnji protonaciji skupine GIS 57: Postopek prenosa protona v vodikovih vezi povzroči spremembo v protonirati skupine imidazola, ki jih je treba sestaviti spremembe njegove vibracijske spektra.
Dejansko se spektri CURS omogočajo razmerje intenzivnosti določenih progah (npr 1164 cm-1 linija) pridobivanje informacij o vsebini te ali (protonirane ali unprotonated) tvorita imidazolov. Uporaba ASR vam omogoča registracijo linija imidazola se ne kaže v spontanem Raman spektra.
Sl. 6.5 kaže CARS spektrometer vezje izdelano za proučevanje biomolekul, za kar je koristno uporabiti impulzne laserje z visoko in relativno nizko povprečno močjo [4]. Osnova spektrometra je laserski YAG: nd, delamo v Akustičko optično preklopom Q in način zaklenjena. Izhodni sevanja je vlak impulzov naslednji frekvenci 5 kHz. Trajanje posameznega pulza v vlaku 80-85 ps, pulzni močjo 0,7 MW. Oscilator sevanjem (1060 nm) po podvojitvi frekvence kristalov LiIOs uporablja "signal" kanal in sinhroni kanal laser z barvilom črpalko. Stalno tuning lasing valovna dolžina tega laserja je nastal v območju 0,56-0,60 mm, kar ustreza frekvenci razliko razdalje VX-V2 = 950-2100 cm-1. generiranje širina črte 0,5 cm-1, trajanje 50-60 ps impulza, pulznim močjo 20 kW. Da bi zmanjšali povprečna moč sevanja drugega harmonika (530 nm) je incident na vzorcu se sprosti iz enotnega impulza vlak. V "signal" kanala sevanja povprečno močjo 30-40 mW, impulznim - 15 kW, širino impulza 50-60 ps.

Sl. 6.5. Diagram poteka spektrometra vozil [4]: ​​1 - YAG: nd laser, 2 - kristali LiI03, 3 - kamera "ahata" 4 - ogledal, 5 - laser z barvilom 6 - Sistem razdeljevanja posamezni impulz 7 - Fresnelova rhomb, 8 - zakasnitev linija 9 - dichroic ogledala, 10 - kivete, 11 - leče, 12 - odprtina 13 - Glan prizma 14, - zaporedni filter motenj, 15-dvojno monokromatorjem 16 - PMT 17 - večkanalni analizator, 18 - Camac moduli 19 - ploter, 20 - računalnik
Drugi harmonično vx in v2 laser z barvilom je osredotočena z lečo na celičnega vzorca. Doseženi anti-Stokes signal vzporednih in je usmerjena z objektivi na vstopno režo za monokromatorjem. Zatreti nonresonant linearno ozadja polarizacijo vx sevanja črpalke in v2 redijo uporabo Fresnelove romba. Z vrtenjem analizator (Glan prizme) blizu položaja maksimalnega zatiranju nonresonant signala doseže znatno spremembo spektra. To omogoča nadzor nad obliko spektra zaradi sprememb pogojev vmešavanja resonančne signala in nonresonant komponent.
VOZILA signala, spektralno filtrira razpršene svetlobe z uporabo dvojnega monokromatorjem pade na FZU deluje v načinu fotonov štetje. Podatki so shranjeni v večkanalni analizator. Registracija, obdelava signalov in pretvorba dye laser izdelan s pomočjo mikro računalnikov.
Skozi amplitudnega polarizacijskim supresijo nonresonant ozadja z uporabo aparata lahko, zlasti vzpostavi hidrofobni okolja imidazolnega obroča v reži med subglobules-himogripsina molekule in pri čemer ima njegovo aktivno mesto nahaja. Sl. 6.6 prikazuje spektre amplitude in polarizacije ASR-kemotripsina v razponu od 960- 1060 cm-1.

Sl. 6.6. VOZILA spekter vodno raztopino a-kemotripsina pri različnih kotih med osjo polarizacijsko analizatorja in polarizacijski vektor nonresonant signala <р: — 1,0° (а), 1,5° (б),
0 ° (c) [4]
V tem območju ležijo frekvenca nihanja značilnostjo aminokislinskih ostankov fenilalanin (1004 cm -1), triptofan (1014 cm-1), kot tudi razteza vibracije C-N (1033 cm-1). Zanimivo je, da vsi ostanki šest fenilalanina, ki sestavljajo beljakovine nahaja v neposredni bližini aktivnega centra.
Vse spektre smo dobili ob pogojih odinakozyh in se med seboj razlikujejo za kot med osjo polarizacijsko analizatorja in polarizacijski vektor nonresonant signala (<р). Помимо подавления нерезонансного фона поляризационная методика позволяет управлять формой спектра, выделяя или ослабляя в нем те или иные линии. В частности, в эксперименте выявлена линия 1010 см-1, которая совсем не проявляется в спектрах спонтанного КР. Вопрос о соответствии этой линии определенным элементам вторичной структуры белка является предметом будущего исследования.
Edinstvena priložnost, da preuči stanje posameznih atomskih skupin, ki se nahajajo na površini makromolekul, daje tudi Sers spektroskopijo 17, 18, 19]. Za veliko število beljakovin in aminokislin, ki sestavljajo zadnjih nekaj let s pomočjo te metode se preiskuje. Zlasti pri vodotopnih proteinov je bila dokazana [19], ki se Raman dobiček opazili samo skupinami atomov, ki so na površini proteina kroglic in interakcijo s kovino. Hkrati se ne zazna linija 1 in amid-amid-3 sers spektri. Očitno je to posledica presejalno učinka peptida skupine stranskih verig iz aminokislinskih ostankov, ki jih loči od površine kovine in ovira učinkovito ojačanje ustreznih vibracij.
Značilnosti sers pri študiju proteini dokazati primer fotoobčutljivega membranskega proteina - bakterijskega rhodopsin (BR). Molekule te transmembranskega proteina izvedemo prenos protona. Razumeti Molekularni mehanizem delovanja BR je treba določiti njeni topografiji kromofornih center (položaj mrežnice ostanka). Sers Postopek spektroskopijo smo uporabili za določitev mrežnice lokaciji glede na membranske površine [20].
V adsorpcije na srebro Hydrosol vijolično membrano, ki vsebuje BR lahko reagira s srebrom kot zunanji in notranji strani (sl. 6.7). Prisotnost pasov spektra izhod kromofor nihanja potrjuje približevanju mrežnice površino membrane. Upoštevajte, da podobnost spektri sers in JRP v 1000-1400 cm-1 pomeni, da protein adsorpcija polienskih veriga trans mrežnice celoti ohrani lastnost BR v vodni suspenziji.
Študija nukleinskih kislin. Izvor Ramanov spekter DNA dobimo iz 1968 G. [21]. Od tega trenutka smo izvedli številne študije z Raman spektroskopijo prostih baz in nukleotidov, njihovih kompleksov z beljakovinami [22], težkih kovin in drugih elementov in sestavin. Dobimo Ramanski spekter naravnih rešitev virusov [23] in kromosomi [24].

Sl. 6.7. RRC spektri Vodna suspenzija rdeče membrane različno koncentracijo: A - 10_6 v - 10-7 mol / l, b - sers spektrom rdeče membrane adsorbiranih na srebrni Hydrosol, koncentracija 10-7 mol / n v spodnjem območju občutljivosti je zvečana pri dvakrat [20]
Možnosti Raman spektroskopijo, naj preuči različne lastnosti nukleinskih kislin se lahko prikaže z talilno DNK poskusa [25]. Sl. 6.8 prikazuje rezultirajoče temperature na različnih Raman spektra DNA, izolirane iz timusa teleta. Ker je temperatura taljenja DNA v območju 80-85 ° C, nato Ramanski spektri se lahko vidi, kaj se zgodi z molekulami med taljenjem.
Preučevanje temperaturna odvisnost specifične Raman spektra anoints da temperaturni profil od intenzivnosti

Sl. 6.8. Ramanski spekter vodne raztopine DNA, izolirane iz priželjca telečjega pri temperaturi 98 (a), 84 (b) in 25 ° C (c) - pH = 7,0 [25)
in frekvence različne medmolekulskih vezi lahko določimo različne kategorije: 1) povezava baze, ki ustreza obračalni zmanjševanja po intenzivnosti linij, tališče navedenega je torej določen pojav predplavleniya- 2) povezovalnih osnov za katero je temperaturna odvisnost šibka ali odsoten .. - 3) dezoksiribozofosfatnye komunikacija temelj za kodebany označen z odsotnostjo odvisnosti temperature pod tališčem in močno ikuensivnosti kapljice na tej točki.
Nekatere vrstice ustrezajo vsem štirim baz (Alenin (A) - timin (T), citozin (C) in gvanina (G)), opravi postopno zvečanje z naraščajočo temperaturo pod tališčem. Ko dosežemo to točko pa je močno povečanje v intenziteti teh linij (npr vrstica T 1240 cm-1 na sl. 6.8). To nakazuje, da so nekatere spremembe v razporeditvi osnovnega glede na drugega (navpično zlaganja) začnejo pride, ker je temperatura 50 ° C, E g. Znatno pod tališčem. Ko doseže tališče DNA molekul spremenijo svoje konformacijo, ki gre od D-obliko, da se tvori naključno neurejenih tuljavo.
Visoka občutljivost z odkrivanjem subtilne konformacijske spremembe v DNA postal sers spektroskopijo. Zlasti zabeležili šibkejše učinke na stabilnost dvojne vijačnice DNK, ki izhaja iz delovanja celo nizkih doz ionizirajočega sevanja [27] in mutagene dejavnike [28].