Diagnostika bioloških predmetov z merjenjem difuzije koeficientov - laser diagnostiko v biologiji in medicini

Diagnostika bioloških predmetov
z merjenjem difuzijskega koeficienta
Translacijskih difuzija. Do danes je največje število raziskav o uporabi kvazi-elastični sipanjem laserske spektroskopije v biologiji nanaša na diagnozo makromolekul: proteinov, nukleinskih kislin in njihovih fragmentov in kompleksi, kot tudi različne supramolekularna in celičnih struktur, viruse, fagov. Tabela. 3.1 prikazuje nekatere tipične primere rezultati hidrodinamičnih vrednostih polmer iz nekaterih bioloških delcev odvzetih [1, 3, 9]. Vse meritve so bile izvedene z uporabo monodinnyh spektrometri. Omembe vredno je majhna napaka merjenja je približno 1%. Primeri več napak v študiji stacionarnih predmetov povezanih, običajno ni brez napak metode, ter vzorčne z nezadostno čiščenje. Prisotnost tujih snovi (npr prahu) ali. Enote povečuje napako.
Tabela 3.1
Translacijske difuzijski koeficient in hidrodinamični premer nekaterih bioloških makromolekul

Merjenje stacionarnih vrednote difuzijskih koeficientov in hidrodinamični radiji tudi teža ni končni diagnostika. Ti parametri so zelo občutljivi na spremembe v okoljskih pogojih (rešitev). Zato je večina študij zabeleži spremembe parametrov in DT GGL diagnozo različne spremembe lastnosti delcev pod vplivom zunanjih dejavnikov. Take spremembe vključujejo denaturacijo, združevanje, imunske reakcije itd konformacijske mobilnosti.
Spreminjanje DT delcev v raztopini se lahko pojavi celo pod vplivom žarka sonde [17]. To velja predvsem za visoko svetlobno absorpcijo rešitev, primer katerih je rešitev hemoglobin. Meritve, izvedene na monodinnom spektrometra pri sipanje kotom 0 = 90 ° z obdelavo signala 20-kanalni spektralni analizator v realnem času določanja napaka DT ni večja od 0,5%, dobimo po postopkih pomembno odvisno od razpolovne širine Lorentz spektra moči sonde grede na hemoglobin molekul z različnimi stopnjami oksigenacijo (sl. 3.5). To je razvidno, da je glede dobimo z ekstrapolacijo slabo nižje intenzivnosti sonde snopa, se vrednost intenzivnost pridobljeni, pri kateri se meritev lahko izvaja brez spreminjanja cilja v raziskavi.

Sl. 3.5. Odvisnost širine MS spekter signala z močjo sonde pramena, merjeno v raztopinah deoxyhemoglobin (1) in oksihemoglobina (2) [17]
Kinetika reverzibilnih sprememb na koeficient difuzije molekul hemoglobina v njihovo združevanje v kompleksih zaradi deoksigenacijo niti možno snemati v raztopini, in znotraj intaktnih eritrocitov - rdečih krvnih celic [18]. Za ta namen, spektrometra, ki na podlagi serijske mikroskopom, ki omogoča korelacijsko spektroskopijo nihanja intenzivnosti v višini približno 8 mm3. Na tak mikroskope- spektrometrom opazili seštevanja hemoglobina v eritrocitih bolnikih s srpasto protoplazmi gibanju anemija notranjosti je zelo majhen (približno 10 mikronov) živih celic (za podrobnosti glej. 3.5). Take apparatura` se da s pridom uporabiti denimo v preučevanje procesov, ki se pojavljajo pri spreminjanju dimenzij med proteina biosintezo in celično diferenciacijo.
Študija agregacije molekul, odvisno od temperature. Močna temperaturna odvisnost stopnje rasti agregatov Pokazalo se je, na primer, za preučevanje agregacijo imunoglobulina monomerov [19]. Pri 39 ° C ni spremembe v polmera monomerov (5,8 nm pri koncentraciji 15,4 mg / ml) ni bilo opaziti tudi 60 ur. Hkrati polmer agregatov dosegel 100 nm za 4 ure pri raztopino segrejemo do 62 ° C.
Merjenje kinetiko polimerizacijo tubulina in mikrotubulov in vitro samomontaži na kvazi-statični temperaturne spremembe prikazano [20], da je koncentracija tubulin v raztopini 1,1 mg / ml, povprečni koeficient difuzije >t začne strmo, vendar reverzibilno zmanjšana pri temperaturi 20-25 ° C. Ko se to začne reverzibilno povečanje polidisperznost. Raztopino znatno in trajno spremeni že začelo v temperaturnem območju 45-60 ° C, kar očitno nakazuje denaturiranje proteina. Nenaden dvig temperature med 7 in 37 ° C, povzroči spremembo >m in stopnja polidisperznosti je več kot trikrat za 20 minut. Dodatek k raztopini 100 umol kolhicina raztopine inhibirana polimerizacije ne občutljiva za temperaturo.
Drug primer metode za preiskavo polimerizacijske reakcije, ki je zelo pomembna v biomedicinskih diagnostiki, je prehod fibrinogena

Sl. 3.6. Čas odvisnost intenzitete sipanja svetlobe (1) in hidrodinamični premer molekul fibrinogena (2) po dodatku raztopine trombina (v času t-0)
fibrin in združevanje fibrina. Ko se rane na telesu stabilnih fibrinogen molekule z encimom trombinom preoblikuje v nestabilno obliko, ki se imenuje fibrin. Fibrin začne polimerizira, da nastane gosto agregate mreže spodbuja celjenje ran.
Sl. 3.6 pollogaritemski kaže skala časovno gibanje povprečne razpršene svetlobe jakosti IV (t) in povprečni hidrodinamični premer GGD (t) fibrinogena molekul v raztopini s koncentracijo 1 mg / ml po dodatku 0,0033 enot / ml trombina. Meritve MS smo izvedli na 60-kanalni fotonov korelator konjugata s računalniku, pri 0 = 90 °, 7 = 37 ° C. Študij kinetike reakcije do prehoda v stanju gela (po 6 urah) pustimo, da zgraditi model interakcije med molekulami postopkom polimerizacije [21].
Drug pomemben primer se nanaša na diagnozo bolezni oči. Na osnovi elastičnega teorijo sipanja svetlobe je dokazal, da se pojavi motnost oko leča zaradi sipanja svetlobe, ki jo konglomeratov makromolekularne proteini [22, 23]. Do danes, z uporabo kvazi elastično sipanje spektroskopije izvedli številne mobilnost študije difuzijsko beljakovin v leče ljudi in živali tako in vitro kot in vivo [24, 25]. Ko predmeti na in vitro raziskave, razpršena svetloba ne-Ne laser (^ = 632,8 nm) z močjo 1-5 mW pod kotom okoli 45 ali 90 ° do fotopomnoževalko, iz katerega je bila pripeljana do digitalni korelator, ki obsega vsaj 100 kanalov, in nadalje računalnik za nadaljnjo obdelavo korelacijsko funkcijo.
Ugotovilo je, da so v normalnih človeško oko lens glavni trosilniki konglomeratov proteini okoli 0,5 mikronov v premeru in iz polydispersed delci imajo premer od 1 do 6 mm [26, 27]. V [28] proučevali porazdelitev konglomerati proteine ​​v lečo prašiča. Izkazalo se je, da je porazdelitev povprečni premer prve komponente delcev 15-23 nm, drugi - približno 0,1 mikronov, tretji - približno 1 mikrometra, in končno četrti - 30-70 mikronov. Porazdelitev vsake vrste konglomeratov v smislu objektiv je precej zapleteno.
Tako je z dinamičnim spektroskopijo lahko opazujemo spremembo strukturnega sestavka leče, kaže v spremembi njenih svetlobno sipanje lastnostmi. Vendar pa je treba opozoriti, da pridobiti zanesljive rezultate iz sondiranja sevanja močjo približno 1 čas merjenja mW v vseh poskusih v razponu od nekaj do deset minut, kar je povsem sprejemljivo, v klinični praksi. Zato so potrebne nadaljnje raziskave, da poveča občutljivost metode.
Kot primer študije agregacije kinetika v imunološke reakcije lahko povzročijo študija aglutinacijski, izvedena za hitro določanje bakterij [29]. Če vizualni pregled prvega opazovanja reakcijski zabeležili po 18 urah, z uporabo fotonov primerjalno spektrometer v nekaj minutah za prikaz začetek postopnega znižanja razpadne pobočju korelacijske funkcije, kaže povečanje povprečne velikosti delcev, in s tem na toku reakcije.
Uporaba fotonov korelacijske spektroskopije omogoča tudi merjenje velikosti porazdelitve dobljenih agregatov bakterij vključno na razredčin večji titer, že v začetnih fazah reakcije, npr. E. sploh seštevanja dveh ali več bakterij. To je seveda pomembna vidika uporabe teh del. Podobne študije so bile izvedene tudi v študiji, in imunološke reakcije, kot obarjalna reakcija [30] in antigenom - protiteles [31].
Rotacijska difuzija. V vseh zgornjih primerih so se je merilo translacijskega difuzijskega koeficienta. Vendar pa v primeru, ko je oblika delcev disperzije ni blizu sferične, in so osno simetričnih ali sferičnih delcev zelo anizotropne v spektru razpršenih nihanj na prostem, kot že omenjeno, prav tako prispeva k usmerjenosti ali rotacijskih dinamike. To se odraža v korelacijske funkcije na tak način, da se z razgradnjo v serijo exponentials v kateri kazalniki razen DT vključuje tudi DB - vrtilna difuzijski koeficient. Pri izbiri določeno število pomembnih pogojev sipanja kotnih v seriji lahko zmanjša na dva dela, ki omogoča izračun koeficientov eksperimentalne krivulje [1, 9].
Druga metoda temelji na merjenju registracijo dB spekter nihanja intenzitetnih depolarizirano razpršene svetlobe komponento [32]. To je posledica dejstva, da ta komponenta zgodi, ko sipanja anizotropno delci. Registracija depolarizirano luč na majhnih sipanja kotih, kjer je prispevek translacijske difuzije zanemarljiv (izraz (3.4)), DB je mogoče izmeriti z veliko natančnostjo. Naravni Težava tega pristopa je, da je intenzivnost depolarizirano razpršene svetlobe komponente običajno nekajkrat nižja od intenzivnosti polarizirane komponente. Vendar pa je uporaba foton štetja tehnologija omogoča to dejstvo ni zelo pomembno. skupne meritve
DT in DB dobimo dodatne informacije o obliki delcev disperzije.
Nadaljnje vrtenje anizotropne makromolekularne gotovo prispevek k spekter signala je narejen hiter intramolekulsko konfiguracijo premikanja: .. upogibne vibracije dolge molekule ali filamentov, dinamike polimernih tuljav, itd Metode za izračun spektre razpršene svetlobe, ob upoštevanju teh premikov, ki se trenutno intenzivno razvit [9]. Dobljene vzporedni eksperimentalni podatki se uporabljajo za testiranje različnih hipotez in modelov.