Laserska spektroskopija kvazi-elastičnega sipanja - laserski diagnostika v biologiji in medicini

Laserska spektroskopija kvazi elastičnega sipanja
To poglavje obravnava možnost uporabe sipanje laserske svetlobe za študij dinamičnih lastnosti bioloških mikro objektov: koeficient difuzije, smer hitrosti prevoza in migracijskih tokov, parametre in znotrajcelično molekularni mobilnost. Od se te izmerjene lastnosti lahko pričakuje, velikost, teža in druge značilnosti številnih leč. To je področje ti kvazi-elastično sipanje svetlobe, pri katerem ni bistvenih sprememb v valovni dolžini sondiranje sevanja v nasprotju z Raman sipanje, o čemer bo govora v poglavju. 6.

3.1. Fizični Osnova metode. Glavne vrste spektrometri

Fizikalne osnove. Naj medij, ki vsebuje razpršitev delcev giblje, pade dvobarvni linearno polarizirane svetlobe vala sondo z valovni vektor E3 D3 (sl. 3.1). Tako kot pri eksperimentu o elastičnega sipanja svetlobe, je razpršena val registriran na oddaljenem mestu pod kotom 0. To je značilna po valovni vektor GV. Če zanemarimo možnost večkratno sipanje in interakcije delcev s seboj, lahko razpršena svetloba se predstavimo kot vsoto prispevkov N neodvisno sipanja delcev hkrati:

kjer Ep0j - amplituda svetlobnega valovanja, ki ga / th delca s časovno odvisnega koordinata r razpršeni, (0, F - faza / -tega razpršeni val, ki se določi z diferencialnim sipanje valovni vektor q = QV-Q3, kot UL = qrj (t ).
Kot smo že omenili, 2-IRN = / K s kvazi-elastičnega sipanja. Zato je povsem geometrijsko iz
Sl. 3.1. Geometrija kvazi-elastičnega sipanja svetlobe poskusa
Sl. 3.1 je mogoče dobiti pri modulom vektorja izražanja razpršilnega val
(3.1)
Omeniti je treba, da lahko poleg koordinatami središča mase delca odvisna od časa in amplitude Ep0j, npr sprememba v postopku merjenja razprševalne karakteristike konfiguracijo ali konformacijo delcev v rotacijsko gibanje brez sferičnih delcev, v nekaterih drugih primerih. Kot rezultat, razpršene val dobimo izraz
(3.2)
To kaže, da je z registracijo začasno spremembo (trend) od amplitude in faze (frekvenco) v razpršenega sevanja načeloma mogoče pridobiti veliko informacij o dinamičnih parametrov trosilniki. še enkrat, da se navidezno elastično sipanje določi z relativno počasnim dinamičnih procesov z značilnimi roki Poudarjamo v območju od 10&ldquo - * - 1 s, kar je znatno višja od značilnega času hitrih intramolekularne vibracij, ki določajo neelastično interakcijo sevanja s biomacromolecules (glej poglavje 6 ..).
Časovne spremembe quasielastically razpršene parametre sevanja se kažejo v spremembi svojih primerjalnih funkcij ali enakovredno, da spremeni svoj frekvenčni spekter. Glede na naravo gibanja leč ali optični spekter širi le, ali je dodatni vrhovi prikazani na preusmerila frekvencah. Vendar pa ti premiki in razširitev konstitutivni glede na testni objekt, tipično od 10 Hz do 10 MHz, so tako majhne, ​​v primerjavi s frekvencami v optičnem območju (približno 5-1014 Hz), ki registrirajo njihovih tradicionalnih metod optične spektroskopije, ni mogoče - celo najboljši optični spektrometri s Fabryjevo - Perot ne more razlikovati v optičnih komponent spektra, ki se nahajajo bližje kot 10 MHz. Zato, za naloge, ki jih je treba opraviti spektralno analizo ultra visoko ločljivostjo.
To je postalo mogoče po razvoju v 60-ih optičnih mešalne tehnike (OS), vpisanih v široki praksi šele s prihodom laserjev. Bistvo te metode je, da pri pomešamo na kvadratno fotodetektor (fotodioda, fotopomnoževalka) svetlobnih valov različnih frekvenc na izhodu fotodetektor tvorjen električnega signala, modulirane razlike frekvenc. Ker je v našem primeru, te frekvence so blizu, utrip signal, je znak, katerega spekter je nedvomno povezano s spektrom razpršene svetlobe. V tem primeru, kot je bilo že omenjeno, se nahaja v nizkem frekvenčnem območju in se lahko podvržemo več optičnih analize, ter z radijskimi sredstvi, ki daje dovolj spektralno resolucijo (do delčku Hertz). Teorija in praktične načine izvajanja OS pri registraciji quasielastic sipanje svetlobe so opisane v številnih knjigah in kritike (glej., Na primer [1-15]).
vrste OS s spektrometri. Razmislite načela dveh glavnih sort teh spektrometri. Monodinnye spektrometri (MS), včasih imenovani tudi homodinske delujejo na samobieny za dodelitev frekvenčnega različne spektralne komponente razpršene svetlobe. Shema MS je prikazano na sliki. 3.2. MS je na voljo na fotodetektor le razpršeni delci raziskoval polje Ep. Če je fotodetektor kot je navedeno zgoraj, registrira brez napetosti in kvadrat jakosti. Zato, izhodni tok je sorazmeren z obsegom 1fp | p | 2. Faktor sorazmernosti, ki je odvisen od kvantne učinkovitosti in sprejemnikom koherentna lastnosti razpršene svetlobe. To je za vse svetlobi, detektirati s sprejemnikom, je skladen, tj. E. Vsi valov z preskušani predmet različnih delcev razpršene, pade na površini svetlobo občutljivega sprejemnika v fazi, trdno snov kot
Zbirka 0 sevanja spektrometri razpršene operacijski sistem je navadno omejena z diafragme. V primeru, da skladnost MS kotom, ki je ovrednotena z izrazomkjer sem - značilno velikost polja skeniran [9].
Izvajanje delovanje kvadriranja izraze (3.2) in izračun moči spekter photocurrent, lahko pokaže

Sl. 3.2. Shema lasersko MS: laser 1, 2- naprava za obdelavo signalov, 3 - limfragmy, 4 - leča 5 - za fotodetektor
da je ta spekter je sestavljen iz treh komponent: stalna komponenta in posneti nihanja spektra hrupa zaznali jakost polja samo izvedbo koristne informacije. Vedite, da je v MS spektra optičnega popačenja v spektru photocurrent se ponavlja le v primeru Gaussove statistike raztresene polje. To se običajno izvaja, ko je število istočasno difuzijski delcev, ki prispevajo k izmerjeni polje, N ^> 1.
Glavna razlika heterodinske spektrometer (WAN) optično mešanje z MS, da razen sevanjem, ki ga raziskovali objekta dobavljene referenco (heterodinskega), npr val s fiksno frekvenco razpršen fotodetektor. Intenzivnost tega vala mora bp večkrat večje od intenzivnosti razpršenega področju. Kot referenca, ki se običajno uporablja del sevanja od istega laserja, ki vznemirja sipanja. Lahko se dovaja fotodetektor ali z uporabo sistema zrcal, kot je prikazano na sl. 3,3, ali pa je lahko svetloba, ki jo nepokretnih trosilniki blizu obsega merilni primer na celične stene razpršene. V nekaterih primerih se lahko drugi laser se uporablja za pridobitev referenčne sevanja, sinhroniziran s prvim.
Učinkovita optično mešanje razpršene valovi in ​​sklicevanje fotodetektor pri gradnji poteka le na usklajevanje njihovih valov frontah. To pomeni, da mora biti geometrija mesta vgradnje elementov, ki opredeljujejo kote pojavnosti in zbiranja na razpršeno detektor svetlobe in referenčno val, tako da so ti valovi skladne. To povzroča nekaj težav pri nastavitvi HS. Vendar pa težave odplačevanju prednosti WAN v primerjavi z državami članicami, ki so v nekaterih primerih so bistvenega pomena.
Ena od koristi, ki izhajajo iz dejstva, da pod pogojem, | g | ^>| p | in visoko mešanjem učinkovitost teh valov

Sl. 3.3. Vožnja laserske GS: simboli so enake kot na sliki. 3.2
6 - ogledala
Koristne g`fP komponenta signala je sorazmerna intenzivnosti referenčnega snopa. Ta okoliščina je mogoče doseči dobiček v vrednosti želenega signala.
Bistveno pomembno je tudi dejstvo, da je težka informativna komponenta moči spektra photocurrent, ki vključuje tudi stalno in komponento hrupa, optični spekter ponavlja neodvisno statistike raztresene na terenu. Poleg tega, za razliko od gradnje v državah članicah, ne le občutljive na premike tipa objektiv nihanj difuzijsko ravnotežje disperzni in naključno migracij, ampak tudi glede na smer vožnje. Ta značilnost gradnje razkriva njihovo tesno povezana s dopleroskim laserskih Anemometri (LDA) - naprave, izdelane posebej za merjenje pretokov tekočin in plinov [13, 14].
Kot je že razvidno iz naslova, je princip delovanja teh naprav, ki temeljijo na registraciji premakne frekvenca sevanja s premikanjem delcev razpršene. Pojav teh premikov v razpršene svetlobe v najenostavnejšem primeru, ko trosilniki gibljeta v isti smeri s konstantno hitrostjo, gledano z analizo ekspresije (3.2). Dejansko, če RJ (t) = r0j (t) + v0jt je

e. faza razpršenih valovi so linearno spremenila pravočasno. Ker je frekvenca valov je čas derivat faze, nato pa to pomeni, da v tem primeru razpršena svetloba postane konstantno frekvenco premike
(3.3)
ob Doppler izvor. tukaj <р — угол между направлениями векторов q и V. Все множество доплеровских сдвигов частоты, содержащихся в рассеянном свете, называется доплеровским спектром. Обращает на себя

Sl. 3.4. Vožnja diferenčni LDA: simboli so enake kot na sliki. 3.2 in 3.3
predstavljajo linearno odvisnost Dopplerjev hitrosti teh delcev disperzije.
Kot en primer, vzetega iz najrazličnejših sistemov LDA razvitih doslej [14], menijo smo prikazano na sl. 3.4 tako imenovani razlika skheiu uporablja v biomedicinskih diagnostiki [7]. V tem vezju regija meritev (ali, kar je pogosto omenjeno, je obseg meritev) tvorjen s presečiščem dveh nosilcev enakega intenzivnosti merilnih elementov in sprejemni sistem, ki obsega, v najenostavnejšem primeru, leče, in dve odprtini. Izhodni signal fotodetektor kot tudi v gradbeništvu, ki je tvorjen z optičnim mešalni fotokatode na svojih dveh področij. Vendar pa v tem primeru, mešani polje, ki jo razpršuje dveh merilnih žarkov. Značilnost LDA je razlika kroga je, da se samodejno dosežena uskladitev dveh valovnih front iz razpršenih valov v širokem prostorskem kotu. Zaradi velikega sprejemno odprtino diferencialno LDA, se pogosto uporablja za merjenje v šibko sipanje medijev. Vizualizacija obsega merilnega na križišču merilnih žarkov omogoča tudi dodatno udobje.
Iz zgoraj navedenega je razvidno, da so LDA in težke naprave istega tipa. Razlika v imenih je zgodovinski narave in poudarja nasprotni strani istega principa merjenja: LDA so namenjeni izključno za raziskave, katerih cilj laminarnega in turbulentnega toka, medtem ko je GS pogosto uporablja tudi za študij neusmerjen (difuzijo) procesov prevoza. V obeh vrstah naprav so podatki pridobljeni, običajno iz korelacijske funkcije ali spektrov za fotocelica izhodnih signalov. Zato se v literaturi in uporabljenih imen, kot so korelacije ali Dopplerjev spektroskopijo.
V praksi je obdelava proizvodnje električnega signala vsakega od teh spektrometri izvaja analognih ali digitalnih metod, ki jih bomo razpravljali v naslednjem poglavju, in zdaj poglej zahteve za osnovni element vseh OS spektrometri - laser. To je posledica, da je dvobarvni, usklajen in zelo usmerjen lasersko sevanje postane mogoče uspešno izvesti operacijski sistem. V večini primerov v spektrometri operacijski sistem, ki je namenjen za študij bioloških predmetov z neprekinjenim enotnem načinu He-Ne laserjev. Niso komercialno dostopne laserji power-Ne (1- 50 mW), je dovolj, da dobimo dovolj za snemanje intenzivnost razpršene svetlobe.
Glavni problem je izbira moči sonde žarka se ne bi motnje v objektu v raziskavi. To še posebej velja za živih objektov - celice, kot tudi drugih predmetov, ki močno absorbirajo svetlobo. Uporaba Multimode laserje lahko privede do napak pri meritvah zaradi dejstva, da lahko razmik v frekvenci med načinu sosednjo prečno primerljivi z značilnimi spremembami v spektrih, ki poteka ob sipanja na bioloških predmetov.
Če govorimo o izbiri valovne dolžine, je pomembno, da je nižja, je več svetlobe razpršeni. Poleg tega je difuzija razširitev spektra je obratno sorazmerna s kvadratom valovne dolžine. Zato je manjši, večji obseg in mehkejše zahteve za sistem za obdelavo signalov. Zato je v nekaterih primerih, operacijski sistem, ki ga spektrometri uporablja CW argon laser, ki oddaja v modro-zeleno valovno dolžino regiji. Pri izbiri valovno dolžino, seveda, moramo upoštevati absorpcijski spekter objekta v raziskavi. V praksi se je, NE laserji prednost zaradi nižjih stroškov in bolj kompakten. Poseben tip laser izberemo tako zaradi stabilnosti sevanje, saj tehnične nihanja zmanjšanje razmerja signala / šuma.