Mikroskopije in microspectrofluorometers - laserski diagnostika v biologiji in medicini

Video: Elektronska mikroskopija bioloških predmetov © elektronska mikroskopija bioloških predmetov

7.2. Laser fluorescenčna mikroskopija
in microspectrofluorometers
Splošne informacije. Uporaba laserjev in metod za obdelavo digitalnih informacijskih bistveno napredoval Microfluorometric diagnostične zmogljivosti. Po eni strani, laserji zagotavlja visoko spektralno gostoto moči sevanja dražljaja, ki lahko je nizko izgubo osredotočena na premer točkovno okoli enega mikrometra. Po drugi strani pa je uporaba skupaj z drugimi napravami, povezanimi z računalniškimi sodobni detektorji video, snemanje ultra intenzivnost dosega preobčutljivi snemanje prostorsko razporeditev fluorofori v celice, membrane, in druge naloge učinkovito v zvezi z merjenjem majhnih količin analitov v različnih modeliranje okolja in biološke strukture.
Kvantitativna analiza mikrospektrofluorimetrichesky biološko aktivnih molekul. Sistem je zelo preprost laser fluorescenčni mikroskop, ki je bila zgrajena na podlagi fluorescence mikroskopom "LUMAM-OF", je prikazano na sliki. 7.2 [9]. Za vzbujanje fluorescence z uporabo neprekinjene ne-CD laser (Rx = 441.6 nm, >z = 325 nm).

Sl. 7.2. Shema impulzni fluorescenčni mikroskop: 1 - laserski 2 - modulatorja 3> 10 - PMT 4 - Teleskopski 5 - polje zaslonka 6 - selektivno ogledalo 7 - leč, 8 - Objekt v raziskavi, 9 - filter, 10 - ojačevalnik-discriminators
11 - enota za povezovanje z računalnikom 12 - računalnik "svečkami 226" 14 - eno oko šoba [9]
fluorescenčno detekcijo izvedemo s pomočjo cevi photomultiplier (PMT) v načinu fotonov štetje na raven enim elektronskim s samodejnim odštetjem ozadja okolice in notranjim PMT hrupa. Valovna dolžina območje - 360-800 nm, dinamično območje izmerjene svetlobni tok - 100 mikronov - 10S, napaka meritve v območju zaznavanja od 1 zabeleži pretoka vsaj 10%, premer vzbujanja sevalnega snopa.
Microfluorimeter uporablja za analizo kvantitativno aminokislinsko za določanje vsebnosti DNA v bakterijskih celicah. Zlasti kromatografski pike skeniranja dobljen pri separaciji aminokislinskih derivatov SBT-CSN-Phe, CSN in CSN-Gly-Jle na ploščah, prevlečenih s poliakridnym upravlja zanesljivo registracijo količino snovi v kromatografski zelo 10/05/14 mol. Ta 1.5 redov velikosti laže doseže trenutno rezultate kvantitativne odkrivanje derivatov aminokislin, ločimo s tankoplastno kromatografijo, dobljene fluorescence s ksenonsko žarnico na vzbujanje.
Eden od glavnih problemov sodobnega celične biologije je določiti koncentracije brez kalcijevih ionov, [Ca2 *] znotraj živih celic. Ta cilj je bil uspešno rešen z laserskim microfluorimetry uporabo fluorescenčnih sond. Denimo, da metode merjenja [Ca2 +] v izoliranih mišičnih celicah [10]. Ker je bil sonde uporabili barvilo indo 1 z največjo absorpcijo v kompleks s Ca2 + pri 331 nm, največjo fluorescenco pri 398 nm in fluorescence učinkovitosti kvantnega 0,56. Fluorescenco smo vzbujali s sevanjem, ne-Cd laserja (X = 325 nm) z razmerjem vklopnih dob sonde snopa je manjša od 1 mW.
Merilni postopek je določitev razmerja jakosti fluorescence pri dveh valovnih dolžinah = 422 in X2 = 468 nm: /?=/(H1)//(A.2) in nadaljnji izračun vendar s formulo [Ca2 +] = S6D (Rmin-R) / (R-Rmax), kjer Rmin in Rmax - R et0 vrednosti pri nič in nasičenje Ca2 +, v tem zaporedju, 0,972- C = sorazmernostna konstanta &d = 250 nmol / l - disociacijska konstanta. Vrednosti RMM, #max in R določimo na kalibrirano raztopine barvila 6 umol.
S tako napravo prvič možno določiti karakteristične vrednosti [Ca2 +] v območju od 100 - 300 nmol / L v živih celicah z natančnostjo ± 10 nmol / L s prostorsko ločljivostjo 2 mikrona v manj kot 0,5 sekunde.
Eden od praktičnih aplikacij laserskih microspectrofluorometers je identifikacija in proučevanje lastnosti pigmentov in barvil v živih celicah. Primeri takega dela so poskusi za študij fotopovedeniya enocelični alg, ki so določene s to metodo organelov, ki služijo kot fotoreceptorjem in photopigment molekulo [P. 7].
Drug primer - registracija v živih celicah fluorescence spektri fotosenzibilizirnega vrsto barvilo hematoporfirina, široko uporabo v medicini, ki se začne v povezavi z razvojem učinkovitih metod diagnosticiranja in lasersko zdravljenje malignih tumorjev. Podrobneje bo ta primer obravnavan v točki 7.3. Joi]
Skupna značilnost teh del je uporaba impulzne nastavljivi laserjev in kinetična meritev z visoko časovno ločljivostjo.
Instrumentalna osnova moderno fluorescenčna mikroskopija, razen laserji in PMT v načinu foton štetje vključuje video detektorji delujejo na zelo nizkih ravneh intenzivnosti fluorescence vzorčenih video okvirjev, njihovo naknadno vnosa v računalnik in digitalno obdelavo. Videomikrofluorimetry ima številne funkcije, ki so pomembne za biomedicinske raziskave: obdelavo hiter informacij, visoko občutljivo detekcijo, digitalno oblikovanje in analizo podatkov, ohranjanje in kopičenje informacij o prostorskih razmerij. Te funkcije omogočajo registracijo prostorske in časovne porazdelitve fluorescentnih komponent v testni objekt s hitrostjo in natančnostjo prej nedosegljive z drugimi metodami. shranjevanje video, magnetni disk ne vsebuje samo 100% zanesljivost njihove ponovne uporabe, omogoča pa tudi raziskovalec vedno znova se nanašajo na njih za matematične obdelave različnih algoritmov.
Microfluor analiza znotrajcelične prometa. Digitalni prikaz slik fluorescentnega objekta je še posebej pomembno v študiji porazdelitve molekul na celičnih membran, intracelularni promet delci Kompartmentalizacija posebnih sond v celice in celične gibljivost.
Na primer, trenutno v teku, naj preuči interakcijo hormonov in rastnih faktorjev na celično membrano receptorje in kasnejše internalizacijo. Eden od ciljev tega članka je pojasniti mehanizme motenj regulacije rasti v rakavih celicah. Najbolj makromolekularne ligand veže na celico, v endocitoze prek receptorjev. Kompleksi liganda - receptorja ovojnice celotna membrana tvorjena iz posameznih odsekih plazemski membrani celice. Oblikovani zaprta mehurčki se prevažajo v celice s posebnimi naslovi, kot so jedra. Ta vrsta prevoza živih celic, in lahko predstavljamo uporabo fluorescenčnih protiteles, povezane z mehurčkov. digitalni postopki povprečenja omogočajo slike za študij naravo gibanja zaprtih mehurčkov na tako nizkih ravneh dražljajev, ki vizualno v fluorescentnih mehurčkov mikroskopom le ni mogoče ločiti od ozadja.
Kot drug pomemben problem, lahko navedemo merjenje translacijsko difuzijo membrane v ravnini in v relativno tanko tridimenzionalnega predmeta. Ta problem je rešen s pomočjo fotobeljenje tehnik. Osnova teh metod je fotobeljenje lokalnih območjih testni objekt, ki nosi fluorescentne molekule, da bi lahko vplivale na njihovo fluorescence in meritev kinetike okrevanja fluorescence zaradi difuzne nondiscolored fluorofori priliv iz okolja v regiji, ki jo je laserski žarek osvetljeno. To območje je lahko v obliki točk, črt ali druge oblike.
Kinetika okrevanja fluorescenčno povezana z razmerjem difuzijo ali pretoka označenih molekul [II]. Na primer, v primeru dvodimenzionalne okrevanje fluorescence v difuzijo omejena objekta difuzivnost je neposredno sorazmerna s kvadratom polmera laserskega mesto v ravnini predmeta, in obratno sorazmerna s predelavo časovni fluorescenčno na polovico začetne ravni. Končna raven, na katero se obnovljena fluorescenca, povezana z mobilno delček označenih molekul.
Trenutno noben drug način ne zagotavlja primerljive podatke o translacijskih mobilnosti molekul na nekaterih območjih membran posameznih celic ali celičnih organelov. Glavne faze poskusa so:
Leto fluorescence od predhodno izbranega območja membrane ali površine tanke velikosti filmsko objekta več mikrometrov-
impulz obsevanje z laserskim žarkom to območje (ponavadi ne-Cd ali Ag), hitro tanjšajo veliko fluorofori med 5-50 mikrosekund, da intenziteta fluorescence tega območja močno padaet-
Meritev kinetike okrevanja fluorescence, od konca Belilo impulz, ki je voden na raziskovali regije z nizko močjo "merjenje" laserskega žarka (običajno 103-105 krat bolj šibko), zanimivo fluorescenca na enak način kot v prvi fazi.
V okviru tega registracijo poskusi fluorescence se lahko opravljajo s fotopomnoževalko. Vendar pa lahko z uporabo video sisteme nudijo priložnost za študij proces okrevanja prostorskega podrobnosti, ki omogoča, načeloma lokalne vrednosti Štetje difuzijskih koeficientov in pretokov na področju študija, kot v notranjosti celice.
Meritev kinetike predelave fluorescence po fotobeljenje metodo za preučevanje agregacije makromolekul in procesov samostojno izdelavo celičnih organelov. Na primer, s to metodo so preučevali smer in mehanizem mikrotubulov polimerizacije. Ker je bil uporabljen fluorofor fluorescein. Meritve omogočiti, da se izključi hipotezo, po kateri so monomeri vključujejo tubulina v mikrotubule v osrednjem delu in izgubi na končnem odseku x.
Preučevali smo kinetiko polimerizacijo kroglaste aktina v vodni raztopini v prisotnosti KC1 soli ali dvovalentne kationov Ca2 + in Mg2 +. V postopkom polimerizacije se oblikujejo dolge (10 - 100 mikronov) F aktinske filamente. Ugotovljeno je bilo najprej dokazali, da je preostali ne-polimerizirane aktina frakcija v prisotnosti rastočih filamentov monomerni oblika G-aktina.
Ta tehnika omogoča natančno sledenje vpliv različnih reagentov v procesu samo-montažo. Na primer, z dodatkom rezultatov citohalazina B v skrajšanju filamentov in dodajanje raztopine aldolazy - protein, ki se veže na aktin filamentov, - šibko poveča mobilni del aktina. Najverjetneje je to posledica nastankom navzkrižnih povezav med snopi aldolaznyh F-aktina.
Najbolj zanimivi so poskusi z živimi amoebas. Z mikroinjiciranje v celico smo injicirali-fluoresceina označenih proteinov: G-aktin, goveji serumski albumin (BSA), so jajčni in ribonukleazo A. Izmerjene vrednosti difuzijo proteinskih molekul v celico v 2-3-krat manjši razmerjih kot v vodi. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da se molekule G-aktina, čeprav je njihova molekulska masa 50% manjša kot pri BSA molekul difuzni počasneje kot BSA molekule. To potrjuje hipotezo navedla že prej, da je celica G-aktin kompleks z drugimi molekulami precejšnjo tipa velikost profilin.
Poleg tega kinetika okrevanja fluorescence po beljenjem opažanje je pokazala, da je fiksni del F-aktina v povprečju približno 10% celotne aktina v celici. V različnih delih razmerja celic je drugačna: v repu - daljše, bolj mobilni vodja del - manj. Na področju plazemske membrane vsebuje do 50-80% neaktivne filamentov. Te in druge študije (npr Samozdruževanje mikrotubulov), kažejo, da je metoda fotobeljenje zelo učinkovite ne le pri merjenju mobilnosti membrane, temveč tudi v študiji prevoza makromolekul v raztopini in v intracelularno matrici.

Video: Medicinska mikroskop XS-90