Histokemija živčnega sistema - osnova za histologijo

V zadnjih letih se pogosto uporablja histološke metode laboratorij neyrogistohimicheskie, da za razliko od klasičnih neurohistological metode zagotavljajo priložnost za opredelitev funkcionalne elemente, značilne za različne dele živčnega sistema. Najpogostejši in so od njih - ta metode za določanje komponent holinergične in adrenergične.

Postopek za sestavne dele detekcijo adrenergični živčnega sistema

 (Postopek Falk - Hillarp brez liofilizacijo) *
Metoda temelji na sposobnosti kateholaminov fluorescenčno po predelavi parov paraformaldehidom v poslanemu ultravijolični žarki. Kot rezultat, struktura vsebuje kateholaminov, svetijo rumeno-zeleno. Opozoriti je treba, da je ta metoda ni posebna le na živčni sistem, ampak tudi na drugih telesnih tkiv, ki vsebujejo kateholaminov (Sredica nadledvične žleze, itd).

* Ta metoda je primerna za detektiranje adrenergične živčnih vlaken v vseh organih razen možganov in pecheni- delati s temi tkivi treba uporabiti po zamrznitvi in ​​sublimacijskem sušenju kosov parafin impregniranje v vakuumu.

Priprava paraformaldehida določene vlažnosti. Glede na želeno vlažnost do dna eksikatorju paraformaldehida zlili žveplovo kislino določeno koncentracijo. Paraformaldehid, ki je v skodelico, hranijo v eksikatorju, da stoji za 7-10 dni.
Shema pridobiti paraformaldehid določeno vlažnost

Za večino oblasti priporočajo paraformaldehid 60% vlage.
Metoda. 1. Kosi pregledanega organa zamrznjene na suhem ledu.

2. Oddelki kriostat pripravimo debeline 15-30 mikronov (odvisno od organa), ki se prenaša na steklo in posušimo v toku toplega zraka za 5-7 min.

3. Namestitev podporo steklo in damo v stekleno posodo prostornina 1 L, zlijemo na dnu katerega 5-6 g paraformaldehida ima ustrezno vlažnost, po katerem je plovilo zapečati ter vloži v termostatu pri + 80 ° C za 60 minut. Rezine smo odstranili in vgrajeni v tekoči parafin (vazelin olje) in pregleda pod fluorescenčnim mikroskopom z uporabo bes filtri 14-4, FS-14, FS-1-2 in blokiranje ZS-18 svetlobni filter (pred in po okenca je treba shraniti v temno, da bi se izognili izumrtje fluorescence).
V reakcijsko nadzor v odseku specifičnostjo iz kozarcev rezine segrevamo v peči pri stekleni valj brez paraformaldehida v enakih pogojih.

Postopek za odkrivanje holinergičnih živčnih sistemskih komponent (splošno bolnikovo metoda)

V nasprotju s predhodno metodo, ki temelji na neposrednem detekcijo kateholaminov v tkivu, je ta metoda temelji na odkritju acetilholinesteraze aktivnost encima, ki katalizira proces cepitev nevrotransmiterja acetilholina na točki lokalizacije (nevrona in njenih okončin). Identifikacijske strukture pojavi kot posledica odlaganja obarvanega reakcijskega produkta encimskega substrata.
Priprava inkubacijskem mediju
Za pripravo raztopin inkubacijski medij uporabimo naslednje.

1. a) 0,2 M NaOH: 0,8 g NaOH + 100 ml H2 O. b) 0,2 M NaH maleinske sol (raztopina):

2,32 g maleinske kisline + 60,0 ml H2O + 0,8 g NaOH in dajanje na 100 ml.
Od dveh raztopin, pripravljenih s prvim delovne raztopine: 26,9 ml 0,2 M 0,2 M 50,0ml OH + NaH maleinske soli + H2O na 200 ml.

1. 0,1 M natrijev citrat: 2,59 g Na3C6H5O7 + 100 ml H2O.
2. C11SO4. 6N2 O: 0,375 g C11SO4 + 50,0 ml H2O.
3. Rdeča kri sol: 0,083 g K3Fe (CN) 6 + 50,0 ml H2O.

Inkubacija medij pripraviti pred uporabo, zmešamo v naslednjem zaporedju in stresamo dobro.
Atsetiltioholinyodida 10 mg
Kislina maleinovokislogo Na 0,2 M (pH 6,05) 13 ml
0,1 M natrijev citrat 1 mL
30 M CuSO4 2 ml
2 ml destilirane vode
K3Fe (CN) 6 maj M 2ml
V kontrolni skupini namesto atsetiltioholinyodida butiriltioholinyodid uporabljajo isto koncentracijo.
Metoda. 1. Kosi testnega telesa (velikost 3x3 mm) so bile za 2,5-3,5 ur pri + 2- + 4 ° C v 4% raztopini formalina, zapufrano na pH 7,6 z 0,075 M fosfatnega pufra, ki vsebuje 0,044 M saharoze.

1. Mokre in damo v 0,044 M saharoze pri + 2 + 4 ° C za 15-16 ur, nakar se na novo mokra in hitro zamrznemo s suhim ledom.
2. Rezano profili v kriostatu (1-30mkm debele), prenesena na steklu posuši na zraku in damo v inkubacijski medij za 60 minut (pri temperaturi + 37 ° C).
3. Prenos steklo z rezino skodelico z 10% formalinom pripravljenega izotonične raztopine natrijevega klorida za 10 minut.
4. Sperite z destilirano vodo dveh odsekov, in sklene karmin odtenek kot običajno v Kanadi balzama.

rezultat. Holinergično komponente, citoplazma neurocytes in živčnih vlaken se obarva v rjavo barvo, katerega intenzivnost je direktno proporcionalna delovanju encima.

Video: Biologija lekcija №45. Zgradba in delovanje možganov.