Identifikacija živčnih celic, ki jih ključnega barvanjem z metilen modro - osnova za histologijo

Pritrdilni material, proizveden po obarvanju, zato vse, ki delajo rešitve tako za barvanje in za določitev je treba pripraviti vnaprej.

delovne raztopine

Najprej pripravimo koncentriran 1% metilensko modro raztopino. V 100 ml tekočine Ringerjevo - Locke raztopimo 1 g metilensko modrega. Rešitev je mogoče shraniti za dlje časa. Pri barvanju razredčimo s tekočimi Ringer-Locke večkrat.
Tekoče Ringer - Locke kot izotoniche9komu raztopine vsebuje snovi natrijev klorid v živalskih tkivih. Pri delu s sesalci lahko porabi tekočega zvonjenje - Locke naslednjo sestavo.

Če je na voljo ustrezna oprema, tekočina Ringer - lahko Locke pred poskusom nasičen s kisikom, ki izboljša življenjsko dobo živčnih celic obarvanje.
potrebno uporabiti kemično čisto kristalinično pripravka za raztopino metilen-modrega barvila, ki je dvojna sol hlortsinkovuyu ali medicinsko uporabo kemično čista metilen modro, brez cinkovega klorida.
Za pritrjevanje snov porabljena pikrat raztopine amoniaka ali amonijevega molibdata. Uporaba samo kristalni amonijev molibdat (7,5 g te soli smo raztopili v 100 ml destilirane vode, nato pa filtrirane raztopine).
Amonijev pikrat raztopimo v količini od okoli 1 g na 100 ml segrejemo (60 ° C) destilirano vodo. Pripravite raztopina mora tik pred poskusom. Uporaba samo rdeče izomere soli. K tej raztopini smo 25% amoniaka segrevamo v vodni kopeli (v digestoriju!) In potem dodali v majhnih obrokih kristalnemu pikrinska kislina, dokler raztopina ne postane nasičen (m. E. dokler se raztapljanje ustavi). Po ponovnem segrevanju je raztopina na površini tanek film drobnih kristalov. Nato končanem segrevanju. Hlajenje je treba izvajati počasi (v vodni kopeli ali zaviti brisačo bučko). Po 12 urah, tekočina prelije in Dobljene kristale amonijevega pikrata takoj raztopimo v destilirani vodi, da dobimo nasičeno raztopino (suha amonijev pikrat treba ravnati zelo previdno, saj ob močnem stresanju in segrevamo eksplozije lahko pride). Destilirano vodo, dodamo tako da ostane na dnu zadostnega števila kristalov, tal. E. Raztopino nasitimo. Pred uporabo smo obe raztopini ohladili na 3-5 ° C z uporabo ponovno dodamo destilirano vodo do nasičenja raztopine.

obarvanost

Tehnika z A. S. Dogiel razvit. Obstajajo različne metode za uvedbo barvilo v telo, živčni elementov, ki naj bi jih razkrili. Metilensko modro raztopino uvedemo skozi krvne žile ali izrezanega iz telesa organa je nameščen neposredno v raztopino barvila. Obstajajo tudi drugi načini: v votlino telesa (prsne, trebušne) vbrizgali barvilo, pri čemer predvsem pobarvali živčne elemente serozne membrane, in nato (ko metilen modro gre v krvi), in drugi organi. Barvilo se injicira neposredno v tkivo testnega telesa. Prvi dve metodi so bolj verjetno.
Euthanize živali s pomočjo anestezije, je treba izpostaviti velik arterijske plovilo najbliže telesa, nevronske elementi, ki so obarvana. Na primer, za odkrivanje živčnih elementov spodnjega uda, izpostavljanje abdominalne aorte nekoliko nad njegovo bifurkacijo, na področju glave injiciranja - .. karotidne arterije v vratu, itd male živali (podgane, morske prašičke, kunce, kittens) kanile bil vstavljen neposredno v aorti . Plovilo je pokazal na ligaturo okoli mesta injiciranja (bližje srcu) in ligirane. Incise plovilo vstavljen v kanilo ima ustrezno velikost in utrditev njene ligature. Gumijasto cevjo (opremljen z zaponko) kanilo povezan s posodo, v katero se tekočina preliva Ringel-Locke, segrejemo na temperaturo 37 ° C. Preden vnesete kanilo, da je to potrebno, z uporabo sponko, da zapolni celotno cev tekočine in kanile. Posoda z Ringerjevo tekočino - Locke okrepitev približno 70 cm nad nivojem kanile, odprt spone in se prenese v posodo za pralno tekočino. Če taka naprava za pranje (in kasnejšo uvedbo barvila) nemogoče zbrati, zvonjenje - lahko Locke in metilen modro daje v brizgo posodi, gumijasto cevjo ga povezuje s kanilo.
Tako po pranju in injiciramo metilensko modro raztopino, segreto na telesno temperaturo živali (s hitrostjo 15 ml 1% raztopine metilen modrega v 1 litru Ringerjevo tekočine - Locke). Barvilo čas injiciranja je treba določiti empirično. V ta namen koščki tkiva injekcijske regije stisnjeno med dvema drsnikoma in pod nizkim povečavi nadzorovati potek barvanja nevronskih elementov. Značilno je, da barva ne presega 40-50 minut. Po injiciranje ni končano, se telo odpre in pustimo 2-3 minut v zraku (pri prisotnost kisika poveča madež živčne celice).
Potem majhne koščke organa izrežemo in damo v termostatu pri 37 ° C jih nasprotno. V ta namen je na dnu skodelice damo filtrirnega papirja navlažili z isto raztopino barvila, ki se uporablja za injiciranje, površina predmeta, ki jo predlaga raztopine barvila se uporablja po kapljicah. Holding košček telesa med diapozitivi, nadzoruje potek obarvanje pod mikroskopom.
Lahko naredite barvanje s potapljanjem telo v barvo. Ta metoda se pogosto uporablja pri delu s tankimi organov, kot so stene votlih notranjih organov. Kos telo cut, poravnajte, dal | v petrijevki na filtrirni papir in nato nalijemo raztopino metilen modrega v Ringer tekočine - Locke. In spremljati napredek obarvanje pod mikroskopom.

Fiksacija in zaključek

Po obarvanju z metilen modrim takoj posneti predmet, zato je pomembno, da se pripravijo vnaprej in v hladilniku ohrani tekočino. Pritrditev izvedemo pri temperaturi 1-3 ° C. določitvi časa, odvisno od velikosti objekta. Pri tankih plasteh, čas pritrditev raztopino amonijevega je 30 minut - 1 ure raztopino amonijevega pikrata -. 3.2 h Debelejši predmeti fiksno 12-24 ur.
V nekaterih primerih je uporaba dvojno zaklepanje: 30-40 minut osnovna raztopina amonijevega pikrat, in nato prenesemo v 1 dan v raztopino amonijevega molibdata.
Po fiksaciji je treba kosi temeljito speremo z destilirano vodo, ki je nadomeščena 5-6 krat, da se odstranijo ostanki soli pritrjevanje. Nato so se hitro prenese skozi 96 ° in absolutni alkohol, ksilen in vgrajeni v balzama. Če želite kuhati rezine, nato nalijemo v Keloidin. Parafinski polnjenje je mogoče le tedaj, ko je opisano zgoraj zaporedno pritrjevanje obeh nasprotnih soli. Membranskih pripravkov in profili lahko dokrasit nobene jedrske barvilo kot karmin galun. Blued nevronske elementi so jasno vidni v ozadju celic okoliške katerih jedra so obarvane z rdečo barvo.
Obvladovanje tehnike supravital barvanje metilensko modro je tudi najbolje, da začnete s takimi predmeti, ki označujejo živčnih elementov najbolj preprosto in poudarjeno.
V ta namen lahko priporočamo gangliji črevesne smenki laboratorijskih živali (najbolje upravljati obarvanja živčnih celic mladih psov in mačk).